深度解讀諾貝爾生理學獎:細胞是如何感知並適應環境氧含量的?

昨天我們已經給大家通俗地介紹了一下2019年諾貝爾生理學或醫學獎，可戳下方藍字回顧。

今天，果殼繼續帶你深入了解細胞是怎樣感知並適應環境氧含量的。

2019年諾貝爾生理學或醫學獎授予了小威廉·G·凱林（William G. Kaelin Jr.）、彼得·J·拉特克利夫爵士（Sir Peter J. Ratcliffe）和格雷格·塞門扎（Gregg L. Semenza）。自現代生物學問世以來，人們便已經了解生命需要用氧氣來維持這一事實。然而，通過此次獲獎的研究，我們才第一次知道了細胞適應氧氣供應變化的分子機制。

當動物細胞周圍的氧氣水平發生變化時，其基因表達就會發生根本性的變化。基因表達的這些變化會改變細胞代謝，造成組織重建，甚至導致心率和通氣量增加等機體反應。

在20世紀90年代初期的研究中，格雷格·塞門扎發現了一種調節這些氧依賴性反應的轉錄因子，並在1995年純化和克隆了它。他將這種因子稱為HIF，即缺氧誘導因子（Hypoxia Inducible Factor），並證明它由兩個部分組成：一個是新發現的，對氧氣敏感的部分，HIF-1α；另一個是先前已知的，恆常表達且不受氧調節的蛋白ARNT。小威廉·G·凱林於1995年起從事希佩爾-林道症候群（VHL，von Hipple-Lindau）腫瘤抑制基因的研究，分離出該基因的第一個全長克隆後，他證明，該基因可以抑制VHL突變致瘤細胞系中的腫瘤生長。此後，拉特克利夫爵士於1999年證明了VHL和HIF-1α之間存在相互作用，且VHL調節了HIF-1α的翻譯後和對氧敏感的降解。最後，凱林和拉特克利夫爵士的研究組同時發現，VHL對HIF-1α的調節取決於HIF-1α的羥基化，這是一種共價修飾，其本身依賴於氧。

獲獎現場 | 東方IC

三位獲獎者的共同努力證明，基因表達對氧變化的反應與動物細胞中的氧水平直接相關，這使得機體能夠通過HIF轉錄因子的作用，立即發生細胞反應以適應氧合作用。

氧氣與動物的生命

18世紀70年代初期，瑞典科學家卡爾·舍勒（Carl Scheele）根據計算發現，大約有四分之一的空氣是他所說的「火氣」，也就是大氣中能讓物質燃燒的成分。這一發現最終於1777年發表。基本上在同一時間的英格蘭，約瑟夫·普裡斯特利（Joseph Priestley）也找到了一種淨化這種以前未知的氣體的方法，他稱其為「脫燃素空氣」。同一時間，安託萬·拉瓦錫（Antoine Lavoisier）在巴黎進行了分離該物質的實驗，並且賦予了它我們今天所熟知的名字：氧氣。

空氣成分 | 圖蟲創意

氧氣對於動物的生命是必需的，氧化反應利用氧氣使食物中的營養物質轉化為腺苷三磷酸（ATP）。確實，根據可利用的氧氣量校準細胞條件是控制代謝的關鍵。早在一個多世紀前，人們就已經發現了這一點，例如，1858年，路易·巴斯德（Louis Pasteur）第一個證明動物細胞中氧氣的使用存在複雜的平衡，並且細胞使用多種途徑來完成能量轉換。75年以前，曾有兩項諾貝爾獎與動物的氧感知機制有關：1931年，奧託·沃伯格（Otto Warburg）因其發現涉及細胞呼吸的酶促基礎而獲獎；1938年，柯奈爾·海門斯（Corneille Heymans）發現了神經系統在對氧氣的呼吸反應中的作用。然而，在整個20世紀的大部分時間裡，人們都還不清楚在基因表達的水平上，機體是如何調節對氧通量的適應性的。

對氧氣變化的適應性

在幾乎所有的動物細胞裡，快速應對和適應氧含量變化的能力都是非常必要的。關於演化過程的分子分類學研究清楚表明，當細胞開始將自身組織成多細胞的三維結構時，這種應對氧通量變化的反應，就不再只是單個細胞內代謝適應的自主反應，它還讓複雜的生理反應得以發展。細胞需要通過許多自主性途徑來適應氧氣水平的變化，尤其是通過調節自身的代謝速率。當從組織與器官水平檢查這種反應時，科學家發現，多細胞生物需要重塑組織，以適應變化了的氧氣水平（例如在創傷後重新構建脈管系統）；也需要調整整個生物體，以補償氧合作用的變化（例如，運動或者處於高海拔時，通氣反應會增加）。

舉個例子：當人處於高海拔時，腎臟中有專門的細胞能夠感受血液中氧氣水平的變化，從而製造和釋放促紅細胞生成素（EPO）。這種激素可以激活骨髓中的紅細胞合成。紅細胞濃度增加能夠幫助我們適應於更低的氧氣分壓。

動物可能會暴露於低氧環境，但重要的是，氧氣水平在組織中也各不相同。動物組織中的氧氣水平在空間上和時間上都有變化；並且，不論是正常的生理事件（例如，骨骼肌用力時，可用的氧氣量降低），還是像癌症及感染這樣的病理過程，這種變化都會發生。20世紀七八十年代的研究清楚表明，這些局部的、暫時的氧氣分壓變化，通過改變基因轉錄，調節細胞和組織中重要的適應反應。這些基因調節反應能夠改變細胞代謝，並且控制基礎的發育、再生、防禦過程，包括血管生成、炎症等許多個方面。

動物細胞感知不同氧氣濃度的能力，以及隨之而來的對基因表達模式的重塑，對於幾乎所有動物的生存都至關重要。由這些途徑所控制的氧氣激活信號通路，能夠影響至少300個分布於各種各樣調控網絡中的基因。這些分子通路滲透於眾多的生理過程之中，從器官發育和代謝穩態，到組織再生和免疫，範圍極廣；並且，這些通路在許多疾病中都扮演了重要的角色，包括癌症。

氧氣與紅細胞的生成反應

任何對動物生命具有深遠意義的信號通路，幾乎必定會涉及許多層次的精細調節，也必定會擁有許多與其他分子通路的交叉點，氧反應通路也不例外。因此意料之中的是，此次獲獎成果在當年發表之後，關於氧反應調控的分子細節也並未就此完結。相反，這幾個關鍵發現打開了整個領域的局面，導致了相關工作的爆炸性發展，揭示了氧通量反應背後的巨大而複雜的分子機制。

圖 | 圖蟲創意

三位諾獎獲得者的基本發現，都是圍繞著缺氧誘導因子（HIF）轉錄因子的作用展開的。這個因子的發現起源於1986年至1987年間許多人的工作，他們發現，缺氧導致腎臟中的促紅細胞生成素（EPO）轉錄表達增加。而這一發現的根源又可以往上追溯到1882年，法國生理學家保羅·伯特（Paul Bert）首次證明了缺氧會產生心血管效應，也首次證明，暴露在高海拔環境會增加紅細胞數量。

缺氧誘導分子的分離

一旦人們意識到EPO基因會被缺氧誘導出轉錄反應，下一步就是確定 EPO 基因調控區中對氧敏感的 DNA 序列是哪一段。格雷格·塞門扎決定用轉基因小鼠來尋找EPO 基因的轉錄調控元件，將人EPO 基因周圍不同長短的DNA片段克隆進小鼠體內。他和同事首先證明，一個包含EPO編碼序列在內的4000鹼基對區域，再加上5'和3'兩端的一些短的側翼序列，能導致所有轉進這些基因的組織生產EPO，並引起EPO增加，從而引發紅細胞增多症。他們接下來又證明，一個更長的EPO基因結構，其5'端有6000鹼基對的側翼序列，能在腎臟中誘導 EPO 表達。這項研究指出，EPO 對氧氣的反應受到複雜的轉錄調控，其中有正調節因子，也有負調節因子。

僅僅一年後，在1991年，塞門扎就發表了另外兩項研究，增加了關於 EPO 基因調控的重要信息。（1）一項DNA水解酶超敏區域的研究找到了 EPO基因 3'端的側翼序列中的一個小區域，該區域能結合多個核因子，至少有兩個核因子能被貧血在肝臟和腎臟中誘導產生；在體外瞬時表達試驗中，同樣是這個小區域起著缺氧誘導增強因子的作用。（2）另一項研究進一步確定了 EPO 在轉基因模型中的轉錄調控。大約在同一時間，彼得·J·拉特克利夫爵士和傑米·卡羅（Jaime Caro）的實驗室的工作表明，EPO基因的3'端存在著起順式作用的 DNA 元件，該元件轉染體外培養的肝癌細胞後，能賦予細胞感受氧氣的能力。

上面所說的研究工作指引塞門扎在1992年鑑定出了EPO基因3 端上一段大約有50個鹼基對的增強子，在體外培養的細胞中，它可以用來誘導缺氧誘導報告基因的表達。這個增強子，塞門扎稱之為缺氧反應元件（HRE），它可結合肝癌細胞中的數種核因子：一個是非誘導性的，另一個則與低氧環境有關。因此，後面的一種因子被塞門扎稱為「缺氧誘導因子」（HIF）。

圖 | 圖蟲創意

拉特克利夫與塞門扎證實，EPO基因3』端的增強子在很多種類的哺乳動物細胞中都可以驅動缺氧誘導的報告基因表達。這表明，EPO基因相關的供氧調節背後的分子機制在各種各樣的細胞中都很活躍，這一發現展現了這種新因子可能是氧含量感知共同的細胞機制中的一部分。

缺氧誘導HIF的過程可以在很多類型的哺乳動物細胞中觀察到，而不僅僅是腎臟和肝臟中那些產生促紅細胞生成素的細胞。這一點讓很多科學家產生了興趣。HIF的發現提示，代謝適應和響應含氧量變化的組織重構背後可能存在一個通用的分子機制。

此時，塞門扎採取生物化學方法從大量細胞提取物中純化了這個蛋白質。作為純化過程中的功能測定，他用「電移位切試驗」測試了EPO基因3』端的增強子。純化蛋白的胺基酸序列分析以及隨後的cDNA克隆顯示，HIF自身是異源二聚體，由兩個不同基因的產物組成。其中第一個成分是HIF因子對氧敏感的部分，被塞門扎命名為HIF-1α；第二部分來自一個恆常表達的基因，一開始它被稱為HIF-1b，直到證據顯示這個成分其實此前就已經被克隆和描述過，它叫芳香烴受體核轉位因子（ARNT）。ARNT蛋白可與其他數種因子結合，而且鑑於它的表達與氧含量無關，很快科學家們便確定HIF-1α是調節HIF氧含量反應性的關鍵。

HIF家族擴張

一個與HIF-1α高度關聯的蛋白於1997年被4個不同研究組獨立克隆出來；一開始它有好幾個名字，包括至今仍在普遍使用的HIF-2α。不過這個基因的正式定名是EPAS1。EPAS1基因編碼一個與HIF-1α有高水平序列同源性的蛋白，並也作為異質二聚體和ARNT結合。它同樣有HIF-1α對低氧條件的敏感性，並且本質上和下述HIF-1α有所有相同的調控模式。

然而HIF-1α和EPAS1在功能上有重要差異。刪除HIF-1α的小鼠引發了一個明確表型（妊娠中期致死），但刪除Epas1基因則會引發多種不同表型，可能是因為遺傳背景不同。此外，大量證據表明，有些低氧響應機制是由二者之一單獨控制的；例如，紅細胞生成主要是由EPAS1控制的。

HIF調節是轉錄後調節，且VHL參與其中

包括拉特克利夫團隊在內，多個實驗室獲得的數據表明，HIF-1α自身的水平是通過改變蛋白質穩定性實現的，而非通過基因轉錄改變或蛋白質合成。多個研究組進一步揭示，HIF-1α通過泛素-蛋白酶通路降解，這一方式是氧依賴的。這一工作還發現了HIF-1α的特定結構域是其氧依賴降解的原因（這個結構域簡稱ODD區，在HIF-1α 和EPAS1中均有表達）。

當氧含量低（缺氧）的時候，HIF-1α被保護住不會降解，並在細胞核裡聚集。它和ARNT相作用，並結合到特定DNA序列的缺氧調控基因（HRE）上（1）。在正常的氧氣水平下，HIF-1α會由蛋白酶體快速降解（2）。氧氣通過為HIF-1α增加羥基（OH）調控了這一降解過程（3）。然後VHL蛋白就可以識別HIF-1α並組成一個複合體，根據氧氣濃度決定是否使它降解。丨諾貝爾獎官網

大約此時——1995年，凱林團隊發表了第一個VHL腫瘤抑制基因的全長序列，並證明將一個野生型VHL轉入一個腎癌細胞系能阻止細胞系形成腫瘤。凱林和許多其他研究組研究了VHL基因及其與家族癌症易感性的關聯。凱林的論文表明，VHL是一種癌症抑制基因，激活這個基因可抑制VHL突變患者的腫瘤生長。1996年，在描述VHL基因的過程中，凱林和馬克·戈德伯格（Mark Goldberg）研究組合作證明，多個HIF靶向基因在VHL突變細胞系中過表達。這一發現表明，兩種通路（HIF響應和VHL相關腫瘤發生）以某種形式相關。

下一個和VHL功能相關的重要線索是識別出VHL蛋白的結合伴侶。凱林小組和其他研究者在1995年發現，VHL能和轉錄延伸因子B和C相互作用。1997年，有科學家發現，VHL是一個複合物的成分，該複合物裡還有Cul-2蛋白——蛋白質泛素化的一個重要因子。這一發現之後被凱林復現。由於延伸因子C和Cul-2在結構上和Skp1、Cdc53有相似之處，而後兩者都已知會針對特定蛋白質造成泛素相關的蛋白質降解，因此這些發現顯示出了VHL和蛋白質降解之間的可能聯繫。

VHL導致HIF成為泛素化和降解的目標

1996~1998年間，人們明確知道了HIF-1α和EPAS1在正常氧濃度下會經由蛋白酶體降解迅速消滅。但是仍然不知道為什麼在缺氧條件下這一降解過程會被抑制。拼圖缺失的一塊在於標記HIF-1α降解的泛素E3連接酶。在這個問題上，拉特克利夫等人於1999年作出了關鍵的突破，在一篇裡程碑式的論文裡，他們表明，VHL複合物和HIF-1α的降解相關。接下來，他們和其他人表明，VHL在這一過程中是泛素E3連接酶複合物的識別成分。

拼圖最後的重要一片是VHL和HIF-1α的反應以及下一步的HIF-1α分解如何受氧氣調控。重要的是，1999年的一篇論文指出，VHL和HIF-1α反應需要有氧和鐵存在。這一發現開啟了對反應機理的搜索：一方面是HIF-1α要經過怎樣的需要氧的化學修飾，才能讓VHL結合上去；另一方面是什麼酶能催化這一反應。當時，已知在膠原蛋白中會出現需要氧氣的蛋白羥基化，並已知受到膠原蛋白脯氨酸-4羥基化酶調控。因此，人們懷疑HIF-1α中脯氨酸基團的羥基化這一需要氧的反應可能會帶來VHL結合所需的構象變化。事實也證明如此。2001年，拉特克利夫和凱林的實驗室同時匯報，HIF-1α的ODD結構域中兩個脯氨酸基團的4-羥基化這一需氧反應增加了VHL複合物對HIF轉錄因子的親和度。這兩篇文章是幾乎同時發表的。

氧依賴性的開關

脯氨酸羥基化反應需要氧氣，這一事實揭示了HIF-1α和EPAS1蛋白質的翻譯後調控機制：缺氧時，不發生羥基化，VHL無法辨認HIF-1α，因此HIF-1α不會被泛素化，從而避免了被蛋白酶體降解，保持完整。結果HIF-1α得以積累，轉錄激活缺氧誘導的基因α程序（見下圖）。

拉特克利夫組和另一個研究組獨立確定了參與羥基化HIF-1α和EPAS1的脯氨醯羥化酶（PHD）基因；這些發表於2001年的論文描述了分離PHD基因的過程。凱林小組也分離出PHD基因，但使用的是生物化學方法，並在2002年發表了這項研究。這些羥化酶的鑑定為製造特殊的PHD抑制劑從而增加HIF的活性提供了可能性，例如，增加貧血患者的促紅細胞生成素水平。

第二個氧依賴性機制是在2001年發現的，此機制不是為了降解HIF-1α，而是為了抑制HIF-1α作為轉錄因子的活性。塞門扎和他的團隊是第一個識別出相關因子的，將其稱為FIH-1，意思是「抑制HIF的因子」。FIH也是一種氧依賴性的羥化酶，這次是負責羥基化HIF-1α和EPAS1的N-末端激活域（NTAD）當中的天冬醯胺殘基。有研究者發現，這種羥化作用能干擾p300轉錄輔助激活因子的募集。這樣，氧不僅通過其氧依賴降解域的脯氨醯羥基化促進了HIF-1α降解，如果有HIF-1α或EPAS1躲開了依賴VHL降解的命運，氧依然能抑制它們的轉錄功能。因此，HIF活性對於氧依賴性轉錄後抑制不是有一個，而是有兩個獨立的機制。這表明，通過細胞氧水平調節，保持HIF水平的適當性、準確性是非常精細的過程。

HIF調控通路的廣闊意義

從那以後，許多研究小組的工作顯示了HIF通路的堅實作用，以及它在調節受氧影響的基因表達中的核心地位。自從三位獲獎者最早的開拓性發現以來，他們一直是這個領域的中心人物。他們參與了HIF通路分子生物學的進一步闡明，並增進了我們對缺氧反應在健康和疾病中所起的生理作用的理解。

調節HIF-1α穩定性的脯氨酸羥化酶被發現後，人們就致力於尋找各種能提高HIF水平的羥化酶抑制劑; 這開闢了一整條藥物發現的新通路。事實上，一些通過抑制脯氨酸羥化酶來提高 HIF 功能的潛在藥物，已經在臨床試驗中走得相當遠了，最近的一系列論文證明了它們在治療貧血方面的臨床療效。

抑制HIF通路，未來也可能有很廣闊的應用。人們設想，有些癌症是因為VHL突變引起，而抑制 HIF 通路或許能成為延緩這些癌症惡化的手段。其中一種是EPAS1功能的特異性阻斷劑，凱林和同事最近報告說，在動物模型中，這能夠減緩VHL突變細胞的腫瘤生長。

通過藥物提升HIF功能，可能有助於治療一系列疾病，因為HIF對許多生理過程都必不可少，比如免疫功能、軟骨形成和傷口癒合。從反面來說，抑制HIF功能也有許多應用：HIF 水平的增加可見於許多癌症以及一些心血管疾病，包括卒中、心臟病發作和肺部高壓。因此，現在很可能只是本屆諾貝爾獎發現被應用的開始，因為很明顯的事實是，細胞、組織和生物體對氧氣的反應，是動物所具有的最重要的生理適應之一。

翻譯：八雲，麥麥，遊識猷，窗敲雨，鍾與氏darla，antares，木易楊楊

校對：odette Ent

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