近年來發展起來的CRISPR-Cas9系統可以高效的對基因進行編輯。通過向受精卵或卵母細胞共注射Cas9和sgRNA可以有效的產生基因編輯的模式動物【1】。然而，注射的Cas9一旦開始發揮作用即具有持續切割的能力，很難在時間及空間水平上精確地控制Cas9的活性，這限制了Cas9注射方法的應用範圍並且突顯出了許多弊端。首先，傳統的顯微注射方法，由於具有持續的Cas9切割活性，其產生的基因編輯胚胎或者動物絕大部分都存在著基因型嵌合，需要經歷長時間的繁育純化過程【2】。其次，目前還沒有一種有效的方法可以在胚胎中利用CRISPR-Cas9技術對親本特異性的位點進行編輯。這些缺陷歸根結底是因為不能有效的對Cas9活性進行時空特異性控制【3】。
2020年9月14日，同濟大學生命科學與技術學院高紹榮團隊在Nature Communications雜誌在線發表了題為Precise allele-specific genome editing by spatiotemporal control of CRISPR-Cas9 via pronuclear transplantation的研究成果。在該項研究中，研究者建立了一種名為Past-CRISPR（parental allele-specific gene-targeting）的方法，能夠高效的對親本特異性等位位點進行編輯並能大幅的降低基因編輯模式動物的嵌合率。
為了在時空精確調控CRISPR/Cas9的活性並實現精確的單等位位點的基因編輯，研究者們提出了兩點假設：第一，在生物體的整個生命周期中，受精卵原核期是能夠區分開父母源染色體組的唯一窗口，提供了對不同親本染色體位點進行操作的空間。第二，受精卵中保留的Cas9/sgRNA可以通過原核互換的方法進行胞質的稀釋作用從而終止Cas9的編輯活性，可以用來精確調控CRISPR/Cas9的活性。基於這兩點假設，研究者在MII期卵母細胞中共注射Cas9 mRNA及靶向目的基因的sgRNA之後進行體外受精（IVF）。等到受精卵發育到PN3-4階段（7~9 h.p.f），將注射組受精卵的雌原核或者雄原核分別取出，並轉移到分別去除雌原核或者雄原核的正常受精卵中重構出二倍體受精卵。理論上，重構受精卵的一套染色體組已經被編輯而另一套染色體組為野生型（Pat-ko/Mat-wt; Mat-ko/Pat-wt）（圖1）。
通過利用Past-CRISPR方法在多個基因位點進行分析驗證，發現在保持正常的編輯效率（85.7%）的同時對各基因位點均具有高效的等位特異性的編輯效率（91.7%）。並且該方法能夠選擇性的對不同親本等位位點進行編輯。同時，Past-CRIPSR方法與傳統的胚胎顯微注射方法相比，能夠產生更低的基因型嵌合率（7.1% VS 84.6%）。
接下來，研究者利用Past-CRISPR方法進行了多種基因編輯的應用。該方法能夠通過一步法對印記基因進行功能及表型的鑑定；該方法能夠快速且有效的產生攜帶有突變致死基因的單等位突變的動物模型，並且證明該致死突變可穩定遺傳給後代；同時，該方法可通過一步法得到沒有基因型嵌合的完全基因敲除的動物模型。最後，該方法還能用於對顯性遺傳疾病的治療，研究人員利用Fgfr3顯性突變導致的侏儒症小鼠疾病模型（Gly369Cys），利用Past-CRISPR方法特異性地破壞顯性突變等位位點從而糾正子代骨發育異常的病理症狀，阻斷了該疾病在子代中的傳播。
總之，該項研究建立了一種親本等位特異性基因編輯的方法（Past-CRISPR），利用原核互換顯微操作技術介導的胞質稀釋作用可以時空特異性的控制Cas9的編輯活性。該方法能夠精確的對特定基因位點進行親本特異性編輯並能大幅降低基因編輯動物的嵌合率，可廣泛的應用於親本效應基因的功能鑑定，疾病治療及動物模型的構建。
據悉，同濟大學生命科學與技術學院高紹榮教授和劉文強研究員為本文的共同通訊作者。同濟大學生命科學與技術學院博士研究生李延鶴為本文第一作者。同濟大學口腔醫學院直博生翁雨藤也參與該研究，該研究也得到同濟附屬口腔醫院王佐林教授的支持幫助。
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41467-020-18391-y.pdf
參考文獻：
1. Wang, H. et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering.Cell153, 910-918 (2013).
2. Ma, H. et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos.Nature548, 413-419 (2017).
3. Maji, B. et al. A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9.Cell177, 1067-1079 e1019 (2019).
來源：BioArt