背景介紹
近年來，隨著腫瘤免疫學研究的發展，一些學者提出了「冷」和「熱」腫瘤的概念，引領了抗腫瘤免疫研究的未來。具有更多T細胞和其他陽性免疫調節細胞的腫瘤稱為「熱」腫瘤，而具有較少或沒有陽性免疫調節細胞和較多免疫抑制細胞的腫瘤被稱為「冷」腫瘤。「冷」腫瘤善於偽裝自身，免疫系統通常無法識別冷腫瘤，並且不會引起有效的免疫反應，這為抗腫瘤免疫治療帶來了巨大障礙。臨床研究指出，大多數腫瘤是寒冷的，調節免疫過程以將冷腫瘤轉變為熱腫瘤已成為抗腫瘤免疫治療的緊迫任務。
光動力療法（PDT）可能導致免疫原性細胞死亡（ICD），伴隨著高遷移率族1號框蛋白（HMGB1）和三磷酸腺苷（ATP）的釋放以及鈣網蛋白（CRT）的暴露，促進樹突狀細胞（DC）的抗原呈遞和成熟。ICD可以將DC和抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）募集到腫瘤微環境（TME），從而將冷腫瘤變成熱腫瘤並激活抗腫瘤免疫反應。但是，冷腫瘤的免疫抑制性TME會損害DC和CTL的功能，從而大大降低光動力免疫療法的功效。打破TME中免疫抑制的束縛是將冷腫瘤轉變為熱腫瘤的一種方法。並且，一定劑量的化學治療藥物（如紫杉醇和順鉑）能夠降低髓源性抑制細胞（MDSC）和調控T細胞（Treg）來調節TME中免疫抑制性。
中國藥科大學孫敏捷團隊合成了氟化順鉑藥物載體（FS-PAMAM-Pt）和氟化光敏劑氯e6（Ce6）共聚物（F-Ce6-PEG），它們可以通過氟-氟（FF）相互作用與全氟化碳（PFC）組裝形成納米簇FS @ PMPt（圖1A）。由於F-F相互作用和PEG保護，納米簇具有良好的穩定性。在通過雷射照射按下，PFC中的氧氣可以確保產生足夠的活性氧（ROS），從而觸發ICD誘導的免疫反應，並增加DC和CD8 +T細胞的浸潤，從而形成寒冷的腫瘤變熱。同時，ROS會破壞ROS敏感鍵並釋放PMPt進入腫瘤，殺死腫瘤內Treg和MDSC，從而打破免疫抑制的束縛，進一步增強光動力免疫療法（圖1B）。相關成果以「Fluorine assembly nanocluster breaks the shackles of immunosuppression to turn the cold tumor hot」為題發表在《PNAS》。
圖 1，FS @ PMPt的製備和免疫調節。（A）F-S-PAMAM-Pt和F-Ce6-PEG的化學結構以及FS @ PMPt納米簇的製備。（B）納米簇FS @ PMPt將冷腫瘤轉變為熱腫瘤的工作機制示意圖。
結果與討論
納米糰簇的製備和表徵
作者首先合成了F-Ce6-PEG，然後通過F-F相互作用將F-S-PAMAM-Pt，PFC和F-Ce6-PEG組裝成ROS敏感的FS @ PMPt和非ROS敏感的FN @ PMPt納米簇。FS @ PMPt和FN @ PMPt都是是球形的（圖2A-B）。由於F-F相互作用的強大力量和PEG的保護，FS @ PMPt和FN @ PMPt均顯示出良好的膠體穩定性（圖2C）。如圖2D中的藥物釋放顯示，一旦受到雷射照射，FS @ PMPt中順鉑前藥的釋放比對FN @ PMPt釋放的快得多（圖2D）。它們均表現出優異的攜氧能力和ROS產生能力（圖2E）。
圖2，納米糰簇的理化特性。（A）FS @ PMPt的透射電子顯微鏡（TEM）圖像。（B）FS @ PMPt和FN @ PMPt的流體動力學尺寸和ζ電勢。（C）FS @ PMPt和FN @ PMPt在10％胎牛血清（FBS）溶液中的膠體穩定性。（D）在有或沒有雷射觸發的情況下，FS @ PMPt和FN @ PMPt的體外藥物釋放。（E）不加或不加氧的納米糰簇在脫氧純水中溶解氧濃度隨時間的變化。
體外抗腫瘤功效
接著，作者為了檢測4T1細胞中PMPt前藥的細胞攝取，將異硫氰酸螢光素（FITC）綴合在PMPt的氨基端，並進行流式細胞術測定。結果表明，雷射處理下，ROS敏感的FS @ PMPt納米簇中的PMPt前藥更快進入細胞（圖3A）。由於其較大的粒徑和PEG封裝，FS @ PMPt滲透性較差，一旦被雷射觸發，其深層穿透能力顯著增強（圖3B）。藥物的攝取和滲透都是為了達到有效的抗腫瘤功效。雷射處理FS @ PMPt 可誘導更多的4T1細胞凋亡（圖3D）。此外，足夠的載氧能力可以通過光動力療法確保產生足夠的ROS，從而促進ICD誘導的免疫激活。FN @ PMPt和FS @ PMPt在雷射照射下表現出強大的ROS生成能力，這確保了PMPt前藥的ROS敏感釋放和進一步的腫瘤滲透。
圖3，體外抗腫瘤功效。（A）在用納米糰簇進行不同處理之後，通過流式細胞術分析了細胞攝取。（B）3D 4T1腫瘤球體在用納米糰簇處理12 h後的代表性Z軸共聚焦圖像。（C）用納米糰簇進行不同處理後4T1細胞的細胞活力和（D）細胞凋亡測定。（E）在對納米糰簇進行不同處理後，通過流式細胞術檢測到的ROS生成。
體內抗腫瘤功效
作者在4T1原位腫瘤模型中評估了納米糰簇的抗腫瘤功效。結果顯示，由於FS @ PMPt的良好穩定性，其抗腫瘤功效更好（圖5A），且在雷射處理時能明顯腫瘤生長抑制作用，腫瘤體積減少，腫瘤細胞形態發生了變化，並觀察到更多壞死（圖5B-F）。這證明了ROS敏感釋放PMPt前藥滲透的重要性（圖5C）。
圖5，體內抗腫瘤功效。（A）給予或不給予雷射的生理鹽水，PMPt，FN @ PMPt和FS @ PMPt給藥後4T1腫瘤的生長曲線。（B）圖像和（C）所收集腫瘤的重量。（D）經過不同處理的4T1荷瘤小鼠的存活百分比。（E）用不同治療方法對收集的腫瘤進行H＆E染色。
體內免疫激活
最後，作者通過流式細胞術檢測CD11c樹突狀細胞上的CD40和CD86表達以推測IDC免疫反應（圖6A，B）。結果表明，雷射處理時，FN @ PMPt和FS @ PMPt可以有效地上調CD40和CD86表達，從而促進DC的抗原呈遞和成熟，激活T細胞並增強CD8 +T細胞。在FS @ PMPt處理之後，CD8 + T細胞浸潤從增加，表明在TME中活化的免疫狀態（圖6C，D），同時Tregs降至7.54％（圖6 E和F），MDSCs降至12.1％（圖5 G和H）。Tregs和MDSCs是TME中最典型的免疫抑制細胞，可極大地抑制APC和T細胞的免疫功能。Tregs和MDSCs的減少表明，納米簇可將冷腫瘤轉變為熱狀態。另外，抗腫瘤免疫反應的激活伴隨有幹擾素-γ（IFN-γ）的產生，TGF-β表達的降低通常代表免疫抑制的減弱。如圖6 K和L所示，FS @ PMPt 雷射處理後，IFN-γ的產生增加了4.4倍，而TGF-β1的表達減少了約53％，進一步證明從免疫抑制性冷腫瘤向免疫激活性熱腫瘤的轉化。
圖6，體內免疫激活。（A）流式細胞術測定和（B）定量分析第15天在淋巴結中通過不同處理誘導的DC（CD11c + CD40 + CD86 +）。（C）不同治療後的CD8 + T細胞浸潤的流式細胞術測定和（D）定量分析。（E）不同治療後的Treg的流式細胞術測定和（F）定量分析。（G）不同治療後的MDSC的流式細胞術測定和（H）定量分析，以及腫瘤中腫瘤浸潤的CD8 + T細胞（I）和CD4 + T細胞（J）與Treg的比率。在TME中通過ELISA檢測到的（K）IFN-γ和（L）TGF-β1。
結論
作者認為這項工作的程序和納米方式主要為癌症免疫療法的臨床治療帶來兩個啟示。首先，對於免疫性冷性腫瘤，應將可能產生ICD的藥物或治療與Tregs或MDSCs抑制劑聯合使用，以實現協同免疫調節和反向免疫抑制。第二，可以開發出精確的可激活納米藥物或納米方式，以統一的方式結合臨床聯合策略，具有出眾的生物安全性和有效性，這為改善抗冷性腫瘤免疫療法提供了範例。
全文連結：
https://www.pnas.org/content/early/2020/12/10/2011297117
來源：高分子科學前沿
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