撰文 | 無欺
責編 | 兮
自從1977年，Sanger發明第一代測序技術-鏈終止法以來，測序技術便成為人們獲得DNA遺傳信息，揭示生命奧秘，發現遺傳疾病規律的最有力手段之一。隨著基因組時代的到來和人們越來越高的基因序列信息的需求，測序技術得以快速發展。雖然，目前二代的高通量測序仍是在基因組測序和轉錄組測序中應用最廣泛的技術手段，但其存在讀長短、成本高、依賴PCR擴增等缺陷。近年來，不需要PCR擴增便可以用來讀取長片段的第三代測序技術-單分子實時測序技術發展越來越快，並在基因組組裝，甲基化鑑定和基因組結構變化等方面得以廣泛應用。目標區域測序技術（targeted sequence）則是通過富集人們關注的基因片段，實現在減少測序成本和人力成本的同時，獲得目標基因片段的高深度覆蓋。
為了結合兩者的優點，研究者們嘗試開發出適合長片段讀長的目標區域測序技術（targeted sequence），從而能夠更好地服務於科研和臨床。然而，目前適合三代測序的目標區域測序技術-PCR擴增和CATCH-seq技術，都存在依賴PCR擴增，丟失基因組修飾信息等缺點【1,2】。
2020年2月10日，來自美國約翰·霍普金斯大學（Johns Hopkins）大學的Winston Timp團隊在Nature Biotechnology發表了最新研究成果Targeted nanopore sequencing with Cas9-guided adapter ligation。本研究詳細介紹了其團隊利用Cas9和納米孔測序接頭連接（adapter ligation）開發出的適合第三代納米孔測序的納米孔Cas9目標區域測序技術 (nanopore cas9-targeted sequence, nCATS)。
Winston Timp 團隊研究人員首先介紹了納米孔Cas9目標區域測序技術（nCATS）富集目標基因DNA片段測序的流程及原理：首先通過鹼性磷酸酶（CIP）去除基因組DNA末端原有的磷酸基團，然後，通過Cas9/gRNA複合物（RNP）在目標區域的兩端切割產生含有磷酸基團的新DNA末端，加入Tap酶和dATP從而將dATP連接到新的含有磷酸基團的目標DNA片段的末端，隨後連接上適合納米孔測序的接頭，上機測序（圖1A）。
為了驗證此項技術的效果，研究人員在基因組上選用了10個已知的12k到24k長度不等的片段作為目標靶向區域。在這10個目標片段中，3個片段包含了癌基因（TP53,KRAS和BRAF）用來測試cCATS在檢測基因突變方面的效果，5個片段包含甲基化修飾位點的基因（KRT19,SLC12A4,GSTP1,TPM2和GPX1）用來測試其檢測基因修飾方面的能力和2個Winston Timp團隊原來鑑定出的包含6k到8k缺失的片段用來評價nCATS在檢測基因組結構方面的功能。研究人員開發的初級納米孔Cas9目標區域測序技術（nCATS）中，在目標區域的兩端各只選取了一個sgRNA。
在研究人員的選用的四個癌細胞系中，初級的nCATS利用納米孔MinION平臺在測試的片段中便能夠取得18x到864x的覆蓋深度。即使利用通量小的納米孔Flongle平臺，也能夠達到8x到65x的覆蓋深度。為了能夠提高nCATS的特異性減少脫靶片段引起的測序浪費，研究人員在目標區域的兩端各選用了多個sgRNA，開發出了增強版的nCATS技術。增強版的nCATS在所有的測試片段中，結合MinION平臺的平均覆蓋深度高達680x，結合Flongle平臺的平均覆蓋深度也達到34x（圖1b）。隨後，研究人員將nCATS應用到組織樣品的研究，在乳腺癌組織/正常組織樣品中也取得93x/70x的覆蓋深度（圖1C）。
圖1
隨後，研究人員測試和優化nCATS在檢測核苷酸多態（SNP）方面的效果，通過比較不同測序深度，不同突變分析（SNP calling）方法，最終利用納米孔突變分析（nanopolish variant calling）結合雙鏈測序結果能夠發現GM12878癌細胞TP53位點的17個已知突變，而沒有一個假陽性。最後，研究人員測試nCAS不同的癌細胞系中分析基因組甲基化修飾和基因組結構-片段缺失方面的靈敏度。在本研究測試的位點中，nCAS在這兩方面都能有出色的表現。
總之，這項研究開發的納米孔Cas9目標區域測序（nCATS）利用Cas9技術和第三代測序技術-納米孔測序技術讀長片段長的優點，實現細胞和組織的低成本，低基因組起始量檢測目標DNA的突變，目標DNA區域的修飾和目標基因組結構的改變。nCATS技術必將在科研和臨床檢測中發揮積極作用。
原文連結：
https://doi.org/10.1038/s41587-020-0407-5
參考文獻
1. Karamitros, T. & Magiorkinis, G. Multiplexed targeted sequencing for Oxford Nanopore MinION: a detailed library preparation procedure. Methods Mol.Biol. 1712, 43–51 (2018).
2. Gabrieli, T. et al. Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH).Nucleic Acids Res.46, e87 (2018).