想要長期持有一個細胞系，最佳的策略是進行低溫保存。這可以有效防止因汙染或技術原因導致的細胞損失。而低溫保存對於維持細胞株的遺傳特性也極為重要。
看似簡單的凍存細胞，如果操作不當，將導致長期培養的細胞付之東流。小編將來自ATCC的《哺乳動物細胞凍存指南》翻譯為中文。看大拿們如何凍存細胞。養細胞的小夥伴不容錯過。
細胞凍存是否成功取決於四個關鍵因素：
1. 適當的處理及溫和收集細胞
2. 使用合適的冷凍保護劑
3. 細胞凍存的速率
4. 合適的儲存溫度
以下程序針對典型的哺乳動物貼壁細胞。然而，這個程序也可以適應各種各樣的細胞；要獲得更多信息，請參考文後的references
未經消毒
•可以標記低溫凍存管的marker筆
•程序降溫盒
•細胞計數板
無菌
•完整培養基，含有血清或任何其他必需的補充劑
•移液器
•15毫升螺旋蓋的離心管
•不含鈣和鎂的PBS（CMF-PBS）
•胰酶
•2毫升螺旋蓋細胞凍存管
•凍存培養基：含有5％（v / v）二甲基亞碸（DMSO）或10％（v / v）甘油的完全培養基
•臺盼藍染色液
凍存前，細胞應處於指數生長期，確保細胞處於健康狀態。理想情況下，應在收穫細胞前24小時更換培養基。建議對培養物進行微生物汙染物，特別是支原體的檢測，並通過適當的方法，如STR分析確定其身份。
如果在培養過程中使用抗生素，那麼建議在冷凍前1到2周不使用抗生素，這樣如果出現汙染，可以更容易地發現。
通常，您可以使用常規用於細胞傳代的實驗程序來收穫細胞。細胞收穫期間儘可能溫和操作。本程序推薦的試劑量是針對為75平方釐米（T-75）培養瓶；若使用其他培養容器，請相應調整所用試劑量。
A 使用無菌吸管，取出並丟棄培養基。請妥善處置與細胞接觸的任何材料和溶液。
B 用5到10ml CMF-PBS衝洗細胞，去除所有痕量的血清。
C 加入3到5ml的胰酶（在CMF-PBS中），37℃孵育。預熱酶溶液通常會縮短處理時間。
D 在倒置相差顯微鏡上每隔幾分鐘檢查酶處理的進展情況。一旦細胞變圓，輕輕敲擊細胞瓶使其脫離塑料表面。加入5 mL含血清的生長培養基滅活胰酶。可能需要劇烈的移液操作來使培養容器底部的剩餘細胞脫落，或將細胞團塊分解成單細胞懸浮液。胰酶的去除或失活對於冷凍細胞至關重要。如果游離試劑不能直接滅活，可以通過下一步的離心去除。
E 用15ml離心管收集細胞。取出樣本進行細胞計數，剩餘的細胞懸液以約100×g離心5分鐘以獲得細胞沉澱。離心時，用細胞計數板對細胞進行計數。使用臺盼藍染液檢查細胞的活性
冷凍保護劑對於冷凍過程中細胞發生的損傷最小化是必要的。最常見的冷凍保護劑是二甲基亞碸（DMSO）和甘油。 DMSO（ATCC目錄號4-X，5×5mL），常用濃度為5至10％（v / v）;最適濃度因細胞系而異。
注意： DMSO是一種非常強大的溶劑，能夠迅速滲透完整的皮膚。因此避免直接接觸DMSO，並妥善處理含有DMSO的廢物。另外，選擇DMSO時，確保使用無毒的產品。ATCC出售的DMSO，已經經過完全測試，以確保其無毒（ATCC目錄號4-X，5×5mL）。
甘油常用終濃度為5％至15％。最佳濃度取決於細胞系。
通常，增加凍存培養基中的血清濃度來增加難以保存細胞的存活率。有時使用高達90％至95％的血清濃度（無培養基，僅血清加上低溫保護劑）。
A 用凍存培養基重懸細胞，使最終細胞濃度達到每毫升2-5百萬個活細胞。
B 在凍存管上標記好細胞名稱，編號和凍存日期等信息。然後將1.0到1.8毫升的細胞懸液加入到細胞凍存管中並密封。
對於大多數動物細胞，通常每分鐘下降-1至-3℃。控制冷卻過程的最好方法是使用程序降溫系統。如果沒有程序降溫系統，可以使用程序降溫盒，然後將其置於-70℃至-90℃冰箱中過夜。雖然這種方法適用於許多細胞系，但不能提供可控的，均勻的或可重複的冷卻，不建議用於珍貴細胞。
無論使用哪種冷卻方法，重要的是快速高效地將其傳輸到最終存儲位置。如果轉移不能立即完成，可以將小瓶置於乾冰上一段時間。這樣可以避免在轉移過程中發生溫度升高而損害細胞。在這個轉移過程中溫度升高是解凍後影響細胞活力的主要原因。
始終保持儲存溫度低於-130°C。細胞可以在更高的溫度下存活，但生存力通常會隨著時間的推移而降低。理想的儲存容器是液氮罐，其中細胞或者被浸沒在液氮中，或者被懸浮在液氮上方的蒸汽相中。出於安全原因（以下＃6），優選氣相儲存。要維護液氮中儲存的細胞需要記住以下幾點：
A 確保標籤系統適用於（永久）低溫儲存。
B 保持良好記錄，包括細胞儲存位置，生長特點和操作記錄。
C 請頻繁檢查液氮罐的狀態（最好每天或至少每周一次）。有多種商用警報系統可用於持續監控其狀態。珍貴細胞應至少存放在兩個不同的地點。
細胞復甦：如果細胞保存在液氮中而不是液氮之上時，應特別注意。如果在儲存期間凍存管發生洩漏，則會緩慢地充滿液氮；在解凍時，液氮轉換回氣相可能會導致爆炸。
安全注意事項：將凍存管從液氮罐中取出並解凍時，請始終穿戴防護服，手套和面罩或護目鏡。
A 通過在37℃的水浴中輕輕晃動解凍細胞。為了減少汙染的可能性，O形圈和蓋子應該保持在水面之上。解凍應該是快速的（大約2分鐘）。一旦內容物解凍，將凍存管從水浴中取出，浸入或用70％乙醇噴灑。之後的操作都應該在嚴格的無菌條件下進行。
B 將內容物轉移到25cm2的組織培養瓶或100mm組織培養皿中，並用完全培養基稀釋。對於大多數細胞系來說，沒有必要立即除去低溫保護劑。正常情況下，解凍後8-24小時更換培養基以除去保護劑。然而，對於對冷凍保護劑敏感的那些細胞系，可以離心細胞懸液以去除冷凍保護劑。然後將細胞放置在細胞培養箱，37℃培養。在細胞恢復期間，避免培養基過鹼。建議在添加細胞之前，將生長培養基置於培養箱中至少15分鐘以使培養基達到正常pH。如果加入新鮮培養基太快，一些細胞系可能會發生滲透壓休克。小體積的緩慢添加培養基可以提高它們的復甦率。
REFERENCES
Freshney RI. Culture of animal cells: A manual of basic technique, 4th ed. New York: Wiley-Liss; 2000.
Hay RJ. Preservation of cell culture stocks in liquid nitrogen. TCA Manual 4: 787-790, 1978.
Hay RJ, Caputo J, Macy ML , eds. Preservation of cell cultures in liquid nitrogen. In: ATCC Quality Control Methods for Cell Lines, 2nd edition. Rockville, MD: American Type Culture Collection; 1992
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