具中科博生研究表明，細胞在冰凍時，形成冰晶的部位和樣品冰凍前的溫度、細胞的特性有關，尤其是和冰凍速率有關。
在-80℃時，細胞酶的活動停止，生理活動趨於停頓；在-196℃條件下，細胞的分子運動完全受到抑制，細胞全部的生理和生化反應停止。要將細胞懸液在很短的時間內從室溫降到-80℃乃至一196℃同時又要儘量減少損傷，降溫的速率是非常重要的，因為降溫速率直接影響到細胞內外結冰的先後、溶液滲透的方向、細胞內外的溶液濃度、冰晶形成的多少及復溫過程。中科博生。
在冰凍速率對細胞的影響中，最重要的是細胞膜對水的滲透性，它直接影響到以下幾個方面：①細胞內外冰晶的形成對細胞的機械損傷；
②細胞內外的滲透壓和pH變化；
③細胞脫水、電解質濃集和蛋白質變性。
對於體外培養的細胞，從滯留期到平臺期都可以凍存，但通常認為處於對數生長期的細胞凍存效果最佳。這可能是由於對數生長期的細胞生命力最旺盛，細胞膜和細胞器對凍存的耐受力最強。基於這個原理，有人認為新分離的細胞由於在分離過程中受到酶和機械力的破壞作用，導致細胞膜不太完整或受損，如果在分離後能夠在一定的條件下培養2～3d凍存效果會更好。中科博生。
探索一種合適的凍存速率是困難的，因為如果降溫速率過快，細胞內水分來不及外滲就已經凍結成冰，在細胞內外同時形成許多冰晶。小冰晶本身對細胞有一定的機械損傷，更重要的是在復溫過程中易附著在尚未融化的較大冰晶表面，形成許多更大的冰晶，對細胞造成損害，此即"胞內冰損傷"(intracllular icedamage）。反之，若以慢速降溫，由於胞外電解質濃度增加，引起細胞膜變性和通透性增加，復溫時導致大量水分滲進入胞內，產生所謂的"滲透性休克"（osmotic shock）。細胞外往往先結冰，並不斷增大，使細胞外液滲透壓增高，導致 胞內水分外滲，逐漸脫水，滲透壓增高，使細胞受損，稱為"溶質性損傷"(so-lute damage)。但是這兩種損傷並不是絕對的，常同時存在，只是根據人們凍存設計方案的不同而在細胞損傷中佔的比例不同而已。因而對於不同的細胞來源，其適宜的降溫速率是不同的。中科博生。
一般來說，結構簡單的小細胞（如紅細胞）,最佳冷卻速率相對要高；而結構複雜的大細胞，其最佳冷卻速率相對要低。對於大多數的細胞，其適宜的降溫速率是-1～-2℃/min。以上即美國人 Mazur 於1972年提出的造成細胞低源填|傷的兩因素理論。此前他於1964年提出了冷凍過程中的熱力學計算方程，闡別了最適凍存速率的形成與細胞膜對水的通透性關係，給細胞冷凍過程一個定量描述，奠定了冷凍保存的理論基礎。中科博生。
通常細胞凍存使用"慢速"冷凍的方法，大多數細胞在溫度不低—10℃時不會結冰。
這種細胞在其冰點以下而不結冰，稱之為"過冷狀態"。推測可能是細胞膜在一10℃以上會阻止冰晶的形成。如果降溫速率足夠慢，隨著溫度的降低 胞外的溶質濃度則逐漸濃縮，細胞呈高度脫水狀態；而在降溫速率不夠慢時細胞脫水則不夠完全，胞內容物將會逐漸過冷，最終使胞內結冰。中科博生。
目前大多數細胞都 可以冷凍保存，研究得比較多的是血細胞、生殖細胞和造血幹細胞。一般的降溫方法有兩種：階段降溫和程控降溫。階段降溫是將細胞懸液按不同的溫度段依次降溫，如將細胞置於4℃30min,-20℃1h,一40℃2h,然後置於一80℃冰箱或液氮中保存。程控降溫是按計算機預先設定的程序，通過開閉閥門來控制液氮的釋放，達到精確降溫的目的。目前使用較多的降溫方法，無論是階段降溫還是程|控降溫，都是基於兩因素理論的"平衡凍存方法",即選擇一種最佳的降溫速率、儘量同時減少"胞內冰損傷"和"溶質性損傷"。中科博生。
實際上還有另一種凍存方法，而且極有發展潛力，那就是20世紀80年代發展起來的生物材料"玻璃化凍存"（vitrification cryopreservation）。這種方法就是 使細胞及其保護劑溶液以足夠快的降溫速率過冷到玻璃化轉變溫度，而被轉化為完全玻璃化狀態(非固態）,並以這種玻璃化狀態在低溫下長期保存。由於在這一過程中細胞內外避免了結冰，從而避免了細胞損傷。其實這並不是一種新技 術，早在1937年Luyet就提出了這一理論和方法。他認為，如果生物材料被快速冷卻，冰晶就沒有時間形成。中科博生。
要實現玻璃化，避免在細胞內外形成冰晶，可以採取的方法有：
①分離去除溶液中的細小雜質，因為這些微粒是晶核生成的主要誘因；
②以極快的降溫速率減少冰晶的生成;
③低溫保護劑的加入可以降低 溶液的冰點，從而降低溶液玻璃化所需的降溫速率；
④ 採用高壓也能夠在一定程度上降低溶液玻璃化所需的降溫速率;
⑤儘量減少樣品的體積，體積越小實現玻璃化越容易。中科博生。
可想而知,在當時的條件下是不可能達到這種速率和具有這樣的科研手段的,因此在經歷了幾次失敗後,Luyet 放棄了。直到1981 年,Fabhy提出,用高濃度的低溫保護劑和高壓,可以在較低的降溫速率下實現生物材料的完全玻璃化。之後,許多玻璃化低溫保存研究工作的重點都集中在發展各種有效的"玻璃化溶液上"。1985年,Rall 和Fahy使鼠的胚胎玻璃化凍存成功而使生物材料的玻璃化凍存到了實際應用階段。他們使用了一種新的玻璃化遊薄|其中含有20.5%的DMSO(作為低溫保護劑)、15.5%的乙醯胺(毒性中和劉、10%的1,2-丙二醇（強化玻璃化形成能力）、6%聚乙二醇（PEG,相對分子質量為8000的非滲透性聚合物)。中科博生。
這種方法也有一些缺點,首先是高濃度低溫保護劑對細胞有一定的毒性;其次是復溫過程中容易出現反玻璃化(重結晶）,在復溫過程中玻璃化溶液易形成冰晶,稱之為反玻璃化。研究發現,較高的復溫速率可以提高發生反玻璃化的溫度,抑制冰晶生長,採用足夠高的復溫速率可以避免冰晶的生長,使用微波復溫是一個新興的策略;第三,難以維持玻璃態的長期穩定性,從熱力學觀點來看,玻璃體中的分子排列處於不平衡狀態,因而不是最穩定的固體狀態,有發生變化的趨勢。中科博生。
對於長期保存的玻璃態樣品來說,如果其內部發生了分子變化,那麼所有努力將付諸東流。此外,要達到10°～10'℃/min 的降溫速率在技術上尚有一定的困難等。
中科博生期待大家一起探討學習。