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生命科學
Life science
2020年1月31日,Cell Press新型冠狀病毒資源中心正式開放。您可以在該資源中心頁面上查找到COVID-19相關論文的投稿政策,以及Cell Press旗下期刊已發表的有關疫情和病毒的論文。網站正在不斷更新中,所有內容都可以免費閱讀,。
最新在中心上線的發表在Cell Press細胞出版社旗下期刊Cell上的研究,名為」 Functional SARS-CoV-2-specific immune memory persists after mild COVID-19」, 來自華盛頓大學的研究團隊對輕度COVID-19康復患者進行了縱向評估,以確定他們是否產生並維持了多方面的SARS-CoV-2特異性免疫記憶,研究發現輕度COVID-19誘導記憶淋巴細胞持續存在,並顯示出抗病毒免疫的功能特徵。這為疫苗研製和抵禦周期提供了非常有利的佐證。
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摘要:
SARS-CoV-2病毒在全球範圍內引起大流行,病例數持續上升。大多數感染者經歷了輕度症狀的2019冠狀病毒病(COVID-19),但尚不清楚這是否可以誘發持久的免疫記憶,從而有助於免疫。我們對輕度COVID-19康復患者進行了縱向評估,以確定他們是否產生並維持了多層次的SARS-CoV-2特異性免疫記憶。康復患者產生了至少持續3個月的SARS-CoV-2特異性IgG抗體,中和血漿、記憶B細胞和記憶T細胞。我們的研究數據進一步揭示了,SARS-CoV-2特異性IgG記憶B細胞隨著時間推移而增加。此外,SARS-CoV-2特異性記憶淋巴細胞表現出與強大的抗病毒功能相關的特徵:記憶T細胞分泌細胞因子並在再次接觸到抗原時增加,而記憶B細胞受體在表達為單克隆抗體時,能夠中和病毒。因此,輕度COVID-19誘導記憶淋巴細胞持續存在,並顯示出抗病毒免疫的功能特徵。
研究發現
為了確定輕度症狀COVID-19後是否會形成免疫記憶細胞,我們收集了15例輕症COVID-19(CoV2+)(UW IRB 00009810)康復患者的血漿和外周血單個核細胞(PBMCs)。CoV2+樣本平均年齡為47歲,報告的輕度症狀持續時間中值為13天(表1)。第一次採血(Visit 1)在SARS-CoV-2的PCR檢測陽性至少20天後,症狀出現後35.5天(中位數)。我們預計,隨著病毒載量在症狀出現後8天左右被清除,這時候主要的反應是感染,記憶細胞群產生(Wölfel等人,2020)。參與者平均在症狀出現後86天再次抽血(Visit 2),這樣我們就可以評估持久的記憶細胞群的數量和質量(圖1A)。我們將這些樣本與17名健康對照組(HCs)在兩個時間點採集的樣本進行了比較,採樣時間間隔相似。所有HCs均未檢測到血漿SARS-CoV-2 RBD特異性抗體或S-特異性抗體,高於2020年之前抽取的歷史陰性(HN)血漿樣本平均值的三個標準差(SDs),因此認為所有HCs之前均沒有SARS-CoV-2感染(圖S1)。
在對SARS-CoV-2感染的最初反應期間,激活的固有免疫細胞和適應性免疫細胞在血液中大量增長(Mathew等人,2020)。當急性病毒感染被清除後,這些高度炎性的細胞大部分死亡,或變成靜止的記憶細胞,因此,總體免疫細胞的比例和表型與感染前的血樣無法區分。與初級反應的結果一致,我們發現在CoV2+和HC個體之間PBMCs的總單核細胞、單核細胞亞群或漿細胞樣樹突狀細胞的數量沒有差異(圖S2)。我們還發現γδ或αβ CD3+ T細胞頻率(CD4+或CD8+)、細胞周期狀態、與各種CD45RA-記憶性T細胞亞群的活化、遷移、功能或比例相關的分子的表達均沒有差異(圖S3A-H)。我們也發現CD19+ B細胞的比例沒有差異(圖S3I)。綜上所述,這些數據表明,與急性感染相關的炎症反應在Visit 1時間點時已經消除,早期免疫記憶階段已經開始。
輕度COVID-19誘導持久的中和抗SARS-CoV-2 IgG抗體
體液免疫反應的特點是產生第一波短暫、低親和力抗體分泌的PBs,隨後是生發中心(GC)反應,產生高親和力MBCs和抗體分泌LLPCs。根據具體的病毒感染狀況,LLPCs可以維持數月到數年的可檢測血漿抗體滴度(Slifka和Ahmed,1996)。PBs在急性SARS-CoV-2感染期間形成,但在症狀出現後大約一個月,康復患者中不再存在PBs(Mathew等人,2020)。這表明,在Visit 1時測得的抗體可能包括已不再存在的大量短壽命PBs,但根據抗體半衰期的計算(大約23天)(Cohen和Freeman,1960),在Visit 2時,估計只有6%的出現在Visit 1的來自PB的抗體會保留。因此,在Visit 2時,LLPCs可能貢獻了大部分抗體,並維持了血液中RBD特異性抗體的水平。因此,我們檢測了Visit 1和Visit 2時血漿中SARS-CoV-2特異性IgG、IgM和IgA抗體水平(Ma等人,2020)。在Visit 1時,所有CoV2+患者的血漿抗RBD IgG水平比HCs平均值高出三個標準差,這是通過ELISA曲線下面積(AUC)測得的,這與第13天血清陽性率100%的研究一致(Long等人,2020)(圖1B)。此外,大多數CoV2+患者在Visit 1次時的抗RBD-IgM和抗RBD-IgA抗體高於陰性閾值,並且IgG、IgM和IgA抗S抗體也高於該閾值(圖S4A)。所有同型的抗RBD和抗S結合水平高度相關(圖S4B)。在Visit 2時,所有CoV2+個體的抗RBD IgG水平都保持在陰性閾值以上,但保持抗RBD IgM和IgA的CoV2+個體較少(圖1B)。在兩個時間點之間,CoV2+個體的抗RBD IgG水平僅略有下降,這表明IgG抗體水平通過抗體分泌LLPCs的形成而趨於穩定。然而,從Visit 1到Visit 2,抗RBD IgM和IgA顯著降低,表明早期PBs的表達不是由LLPC維持的(圖1C)。
由於spike蛋白,特別是RBD,是病毒進入細胞的關鍵,針對RBD的抗體可以成為感染的有效抑制劑(Robbiani等人,2020;Shi等人,2020)。為了確定CoV2+個體是否形成並維持中和抗體,我們使用RBD-ACE2結合抑制的無細胞分析(替代病毒中和試驗,sVNT)間接檢測SARS-CoV-2中和作用,並使用菌斑減少中和試驗(PRNT)直接檢測(Tan等人,2020年)。CoV2+血漿抑制RBD與ACE2的結合明顯高於HC血漿,RBD抑制與兩個時間點的抗RBD IgG水平密切相關(圖1D和1E)。此外,從Visit 1到Visit 2,CoV2+血漿RBD抑制能力保持不變(圖1F)。PRNT的中和作用在兩個時間點都與RBD抑制密切相關(圖1G),並且在兩次隨訪之間保持類似的中和作用(圖1H)。在兩個時間點,大多數CoV2+血漿通過PRNT在1:160稀釋度的情況下達到了至少50%的中和作用。到我們研究的最新一個時間點,大多數CoV2+個體仍比HCs具有更好的RBD抑制血漿和更好的中和血漿。這些數據與IgG+ RBD特異性LLPCs的出現相一致,這些LLPCs在症狀出現後至少三個月內可檢測到中和抗SARS-CoV-2抗體。
輕度COVID-19誘導RBD特異性IgG+記憶B細胞持續富集
CoV2+患者症狀後3個月出現的SARS-CoV-2中和抗體提示GC衍生的LLPCs已經形成。GCs也產生了持久的MBCs,在抗原再暴露後產生分泌PBs的高親和力抗體中起關鍵作用。因此,我們測試了在整個研究過程中,是否在CoV2+個體中形成並維持有SARS-CoV-2特異性MBCs。我們生成了RBD四聚體試劑,並使用富集策略來識別和表型罕見的無法檢測的RBD特異性B細胞,(Krishnamurty等人,2016)。我們在RBD免疫小鼠中測試了我們的試劑的特異性(Walls等人,2020),然後用它來識別、計數和表型來自HC和CoV2+個體的PBMC中罕見的RBD特異性B細胞。用於表型RBD特異性B細胞的期限在B細胞總數上得到定義(圖S5A)。
在Visit 1時,與HCs相比,CoV2+個體中的RBD特異性B細胞增多,從Visit 1到Visit 2,CoV2+個體中的RBD特異性B細胞數量顯著增加(圖2A和2B)。正如預期的那樣,我們在HC或CoV2+個體的血液中發現了極少數的CD20- CD38+ RBD特異性抗體分泌細胞(PBs或PCs)。這支持了一種觀點,即LLPC(可能在骨髓中)在Visit 2時產生了大部分RBD特異性抗體(圖2C)。CD21和CD27的表達將CD21+ CD27-幼稚B細胞與CD21+ CD27+經典MBC和CD21- CD27+/-激活的MBCs區分開來(Weisel和Shlomchik,2017)。在CoV2+個體中,絕大多數RBD特異性B細胞是CD21+ CD27+經典MBCs,而HC個體中的RBD特異性B細胞大多數是幼稚B細胞(圖2D和2E)。CoV2+樣本中RBD特異性MBC的數量平均顯著高於HCs,並且在Visit 2時進一步增加(圖2F)。B細胞受體(BCR)從IgM和IgD轉變為IgG、IgA或IgE,與形成高親和力中和抗體所需的BCR親和力成熟有關(Weisel和Shlomchik,2017)。CoV2+RBD特異性MBCs富集於IgG+ MBCs,而較少數量的HC RBD特異性MBCs主要是未轉變的(IgM+和IgD+)(圖2G、2H和S5B)。最引人注目的是,在Visit 1時與HC個體相比CoV2+個體中IgG+ RBD特異性MBC數量的增加甚至在Visit 2時進一步增強(圖2I)。相對較少的CoV2+RBD特異性MBC表達了IgA,但在這兩個時間點,其數量均明顯高於HC個體(圖S5B)。
抗病毒MBC功能的另一個衡量指標是T-bet的表達(Knox等人,2017a)。表達T-bet的MBC與在繼發感染期間產生高親和力的病毒特異性抗體的次級PBs的快速分化有關(Knox等人,2017b)。我們發現,在Visit 1時,CoV2+患者的T-bet+ RBD特異性MBC的數量平均高於HCs,並且在Visit 2時保持較高的數量(圖2J)。這些數據表明,IgG+ RBD特異性經典MBCs不僅在輕度COVID-19的反應中形成並持續存在,而且其數量在症狀出現後1-3個月持續增加。
SARS-CoV-2感染誘導持久、功能性spike反應性記憶CD4+T細胞
T依賴性IgG+ RBD特異性MBCs的存在提示CoV2+個體也存在抗原特異性記憶T細胞應答。為了計算SARS-CoV-2特異性CD4+記憶性T細胞,我們將HC或CoV2+個體的總PBMC與載體對照或spike蛋白一起培養,並在20小時後評估激活標記物的表達(圖3A)(Bentebbel等人,2013;Reiss等人,2017)。我們首先關注了特異性T-B受體配對成員的活化誘導表達,包括ICOS和CD40L。在Visit 1和Visit 2時,來自CoV2+個體的CD4+T細胞在用spike蛋白重新激活後,與載體對照組相比,ICOS和CD40L的表達增強(圖3B)。在少數HC個體中也可以發現少量的spike反應活化的CD4+T細胞,但平均而言,這些細胞在整個HC隊列中沒有顯著增加。此外,在Visit 1和Visit 2之間,CoV2+個體中應答細胞的數量沒有顯著差異,這表明在整個研究過程中spike特異性記憶CD4+T細胞得到了維持(圖3B)。此外,與HC患者相比,CoV2+患者的再刺激樣本中發現更多表達CXCR5的循環性T濾泡輔助細胞(cTfh)細胞(Vinuesa等人,2016),並且在兩次採樣之間保持不變(圖3C)。這些數據表明,SARS-CoV-2特異性記憶性CD4+T細胞在症狀出現後三個月內仍能維持,有些細胞還可以提供B細胞幫助。
抗原特異性記憶CD4+T細胞增殖以使記憶細胞群重新增殖,並在抗原再次暴露時產生效應細胞(Sallusto等人,1999)。為了正式證明CoV2+個體中spike特異性CD4+T細胞在再次刺激前具有記憶表型,我們測量了對spike再刺激作出反應的預分類記憶或幼稚亞群的增殖能力。為此,我們分揀出來自HC或CoV2+個體的CD45RA+幼稚、CD45RA- CCR7+中央記憶(TCM)和CD45RA-CCR7-效應器記憶(TEM)T細胞,並將其與自體CD14+單核細胞和重組spike蛋白一起培養5-6天(圖S6A)。接下來,我們測定了細胞增殖的頻率,並因此在培養5-6天後稀釋了細胞增殖染料(CPD)(圖3D)。我們還檢測了CCR6+(與產生IL-17的Th17細胞相關)和CXCR3+(與產生IFN-γ的Th1細胞相關)的表達,因為Th1和Th17亞群與其他呼吸道病毒感染的保護相關(Sallusto,2016)。在CoV2+個體中,經過5天的培養,從分揀的幼稚細胞中出現了少量增殖(CPDlo)CXCR3+ CD4+ Th1細胞,可能代表汙染的記憶細胞,因為這些細胞在HC個體中沒有發現(圖3E)。與HC樣本相比,所有CoV2+個體中分揀出的TCM細胞顯示出明顯更高的CXCR3+ CPDlo T細胞的比例,這些T細胞隨著spike而增殖。儘管在一些CoV2+個體中TEM細胞中觀察到了大量的增殖反應,但在CoV2+組中觀察到的變化更大。這些數據表明,在從輕度COVID-19恢復的個體中,主要是表達spike特異性TCM的CXCR3,以及一些表達TEM的CXCR3,持續存在並有能力在再次遇到抗原時增殖並使記憶細胞增殖分化。
記憶T細胞迅速表達多種細胞因子來參與、補充或激活固有細胞或其他適應性淋巴細胞。接下來,我們對CoV2+和HC患者Visit 2時持續存在的spike反應性記憶T細胞的細胞因子譜進行了詳細分析,以更好地了解SARS-CoV-2特異性記憶細胞功能。CD4+ CXCR5+記憶性Tfh細胞產生特異性細胞因子可以影響B細胞的激活和類別轉化,而CD4+ CXCR5- T效應器(Teff)細胞表達高水平的細胞因子參與抗病毒治療。我們檢查了各種輔助性T細胞亞群產生的細胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17),並在PMA/離子黴素激活的CD69+細胞上確認染色(圖S6B所示的代表圖)。通過CCR6和CXCR5的表達,激活的CD69+ CD4+記憶細胞進一步成為亞群,因為在SARS-CoV2感染後的早期,spike特異性CCR6+ CXCR5+ cTfh的主要群體最近得到了描述(Juno等人,2020)(圖S6C)。在spike再刺激後,與對照組相比,CoV2+樣本顯示出大量激活的細胞因子生成細胞,而一些HC樣本顯示出少量激活的細胞因子產生細胞(圖3F)。CoV2+樣本中細胞因子的產生主要由IL-2和IFN-γ的表達所控制,IL-17A的產生頻率較低,未觀察到明顯的IL-4產生(圖3G和S6D)。spike反應性CCR6-亞群表達IL-2和IFN-γ的頻率高於CCR6+細胞,而少數IL-17產生者如預期一樣表達CCR6。綜上所述,這些數據表明,功能性spike特異性記憶CXCR5+ cTfh和CXCR5- Teff細胞在症狀出現後3個月持續存在,這些細胞主要產生Th1細胞因子,並有少量產生IL-17A的細胞群。
雖然最近的研究主要集中在抗體和B細胞上,但記憶CD8+T細胞也具有其獨特功能,可以通過直接表達細胞因子和細胞溶解分子來殺死病毒感染的細胞。因此,我們在上述相同的細胞因子活化試驗和樣本中研究了是否存在功能性CD8+記憶T細胞。在COVID-19輕症後持續3個月的spike特異性記憶CD8+T細胞可通過與SARS-CoV-2 spike培養20小時後表達活化標記物CD69和細胞因子IFN-γ的表達來識別(圖3H)。然而,與CD4+記憶T細胞不同,HC和CoV2+組中表達CD8+T細胞的活化細胞因子數量顯著增加(圖3I)。這些數據共同表明,輕度症狀的COVID-19個體在症狀發作3個月後再刺激,Th1 CD4+ SARS-CoV-2特異性cTfh和非Tfh記憶T細胞能夠維持並產生效應細胞因子。這些數據進一步表明,健康對照組中存在大量產生IFN-γ、交叉反應性的CD8+T細胞。
SARS-CoV-2特異性MBCs可表達中和抗體
由於SARS-CoV-2 RBD特異性MBC和S特異性CD4+ cTfh三個月後在CoV2+個體中富集,我們想要知道這些MBC是否有可能在繼發感染後產生中和抗體。為此,我們對單個RBD特異性B細胞進行索引分揀,並在兩個時間點對來自三個CoV2+個體的BCRs進行測序(圖S7A和4A)。我們對所有IgG+ RBD特異性經典MBCs(CD21+ CD27+)進行測序,克隆出成對的重鏈和輕鏈序列,並將其表達為IgG1單克隆抗體。總共包括19個來自Visit 1的抗體,16個來自Visit 2的抗體。
這些抗體首先在小規模培養基中表達以用於篩選。用IgG ELISA(圖S7B和S7D)評估轉染上清液的抗體表達,通過RBD ELISA檢測了特異性,其中每個時間點除1抗體外,所有抗體均與RBD具有強結合性(圖4B和4D)。然後用sVNT試驗評估抗體抑制RBD與ACE2受體結合的能力。在Visit 1時從受試者克隆的18個抗體中有8個(44%)能夠抑制RBD與ACE2的結合,Visit 2時的15個受試者中有7個(47%)(圖4C和4E)。雖然Visit 1中有2種抗體顯示出較低的抑制水平,但其他抗體的抑制水平與強中和羊駝納米體相似(Hanke等人,2020)。這些抗體隨後在更大的規模上表達並純化以進行更詳細的分析。純化抗體對RBD的特異性再次通過ELISA進行驗證(圖S7C和S7E),並通過PRNT試驗檢測了所有Visit 2抑制劑、大部分Visit 1抑制劑和幾種非抑制劑的SARS-CoV-2中和能力。所有的抑制抗體都能強烈中和病毒,IC50值在7.15到49.61ng/ml之間(圖4F和4G)。這與先前發表作為陽性對照(IC50=3.6 ng/ml)的強中和小鼠抗體(2B04)相當(Alsoussi等人,2020年)。其中兩種非抑制性抗體(#205和#211)無法如預期那樣抑制病毒感染,類似於一種非中和小鼠抗體(2C02)和一種無關的瘧原蟲特異性人抗體(MSP-003)。有趣的是,另外兩種測試的非抑制性抗體(#203和#207)能夠中和活病毒,其中#203的IC50與強抑制劑(15.4 ng/ml)相當,這表明sVNT試驗不能檢測到所有能夠中和活病毒的單克隆RBD特異性抗體。超過50%的被測抗體在其中一種或兩種方法中顯示出活性。
這組抗體使用了多種重鏈和輕鏈,都經歷了體細胞超突變(SHM),並且都是唯一的克隆(表2和S1)。在Visit 1和Visit 2期間,重鏈和輕鏈的SHM水平平均升高,但這些差異沒有統計學意義(圖S7F和S7G)。因此,由SARS-CoV-2感染誘導的RBD特異性MBCs能夠產生多種中和抗體,並有助於在第二次接觸時提供保護。
康復個體形成了多方面的SARS-CoV-2特異性免疫記憶
在對麻疹、脊髓灰質炎和A型肝炎等人類病毒感染的應答中,病毒特異性IgG+抗體、IgG+ MBCs、CD4+記憶T細胞和CD8+記憶T細胞的數量和功能與長期保護作用相關(Amanna等人,2007;Plotkin,2010)。雖然我們還不知道免疫記憶中的哪些成分足以在第二次暴露於SARS-CoV-2提供保護,但這些成分應該發揮協同作用形成多層次的防禦。
為了確定我們隊列中的CoV2+個體是否形成和維持了多個免疫記憶成分,我們對每個個體進行了SARS-CoV-2特異性功能性免疫記憶成分的評估,這些成分在Visit 2時在CoV2+個體中存在顯著差異,因此,可能會影響對第二次接觸的保護作用。HCs和CoV2+個體按感染狀態分組,Visit 2時免疫記憶的獨立指標值在heatmap圖中得到報告(圖5)。由於我們還不知道這些度量標準的保護閾值是多少,因此我們將每個度量標準(行)的HCs值的平均值之上的一個標準差設置為閾值(色階為白色)。這使我們能夠看到哪些CoV2++個體的反應高於在HCs中檢測到的。我們的序列中的所有14名CoV2+個體在Visit 2時形成並維持免疫記憶的多個成分,其水平高於HCs。除一例CoV2+個體(CoV2+ 8)外,所有CoV2+個體的RBD特異性IgG+抗體效價均高於HCs,RBD-ACE2結合的血漿抑制作用增強,並且RBD特異性IgG+ MBCs的數量均高於HCs。大多數CoV2+個體(11/14)也保持了比HCs更高數量的能快速產生效應細胞因子(IL-2、IFN-γ和/或IL-17A)的刺激性CD4+記憶T細胞。與HCs相比,少數CoV2+個體(5/14)也具有更多數量的的spike反應性、能產生IFN-γ的CD8+記憶T細胞。這些數據表明,我們序列中的所有CoV2+個體都形成並維持了多種功能性、適應性免疫記憶成分。
相關論文信息
原文刊載於CellPress細胞出版社旗下期刊Cell上
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▌論文標題:
Functional SARS-CoV-2-specific immune memory persists after mild COVID-19
▌論文網址:
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)31565-8
▌DOI:
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.029
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中文審校:Cell科學編輯 楊揚
Cell Press新型冠狀病毒資源中心
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原標題:《輕度COVID-19後體內新冠病毒免疫記憶持續 | Cell Press新冠中心論文速遞》
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