回顧MD Anderson在RPPA技術領域的開山之作‖中美聯合在線研討會

北京時間：2020年10月15日 上午09:30

RPPA（反相蛋白微陣列）技術是一種可靠的、成熟的、高靈敏和高通量的系統蛋白組學分析技術。這種分析方法的獨特性，在於能夠同時分析成百上千個樣本（細胞或組織裂解物），並進行平行蛋白組學差異表達比對分析，包括其活化水平，例如磷酸化、甲基化、乙醯基化等，且具有其它高通量蛋白組學所不具備的定量優勢。本次研討會邀請了美國貝勒醫學院的Shixia Huang博士和中國非因生物的王楠博士一起來探討RPPA技術的優勢和面臨的挑戰。

講者介紹

Shixia Huang, PhD

Director, Proteomics Core and Associate Professor,

Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

演講主題：Reverse Phase Protein Array as a Discovery Platform for Cancer Research

王楠, PhD

CTO, 非因生物（Mills癌症個體化診療中心）

演講主題：基於RPPA功能蛋白組學的腫瘤系統藥理學及生物標誌物研究策略

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講座開始之前帶您一起回顧MD Anderson癌症中心在RPPA領域的開山之作

——Comprehensive molecular portraits of human breast tumours

（October 2012,Nature 490(7418):61;DOI: 10.1038/nature11412）

研究背景

乳腺癌是全世界範圍內最常見的婦科腫瘤（如圖1），每年有新增確診超過130萬例，每年死亡人數超過45萬例。早期在臨床分型上，這種高異質性的癌症根據雌激素受體表達水平（Estrogen Receptor, ER）、孕激素受體表達水平（Progesterone Receptor, PR）和 HER-2拷貝數增加來進行針對性的治療方案及策略選擇。對於荷爾蒙受體陽性的病人，主要採用內分泌療法，對於HER-2過表達的病人，則採用以HER-2抑制劑（Herceptin）為主的靶向療法，而對於荷爾蒙受體及HER2表達陰性的三陰性乳腺癌（Triple negative breast cancer TNBC）一線仍然採用以化療為主的治療方案。

圖1

全球乳腺癌發病率/死亡率統計（2018年）

隨著基因組學和轉錄組學技術的發展，乳腺癌作為較早進入分子分型時代的癌種，已經在臨床檢測上得到了廣泛的應用，其中以Oncotype DX20基因，PAM50基因, MammaPrint 70基因最為著名。此類檢測基本都將乳腺癌分為4種分子亞型：管腔A（Luminal A型）、管腔B（Luminal B型）、HER-2過表達型和Basal-like型（基底細胞樣型/三陰性）。然而臨床研究表明，基於這些分子分型的方法仍然存在一定缺陷，約有潛在的1/3的臨床病例仍然不能被準確分型，因此更好地從全方位了解乳腺癌的分子全貌就顯得尤為重要。

大多乳腺癌的分子學研究都集中在數據量比較豐富的1個或2個技術平臺，由於大規模平行測序技術的發展，越來越多的組學數據開始在乳腺癌中產出，包括了mRNA表達譜、DNA拷貝數分析、甲基化數據，microRNA表達。基因組學層面的分析與檢測已經從實驗室走向了臨床應用，為乳腺癌的診斷與治療提供了豐富的資源。而這僅僅是癌症精準醫學的開始。「Comprehensive molecular portraits of human breast tumours」（圖2）則是2012年TCGA項目利用多組學技術，對乳腺癌分子水平進行系統性、大規模研究的一個裡程碑，這篇文章描述的內容被譽為醫學界第一次運用高通量多組學技術、全面剖析乳腺癌分子分型的開元性工作，不計其數的科研和臨床工作者都對其進行了深入的解讀，以至於在發表後的兩年內成為了除綜述外引用次數最多的臨床醫學研究類論文之一。

圖2

為更好地全方位了解乳腺癌的分子全貌，這篇文章首先提出了多組學聯合分析的必要性，並通過DNA基因拷貝數、DNA甲基化、miRNA測序、mRNA測序、全外顯子測序和反相蛋白微陣列（Reverse Phase Protein Array，RPPA)等6種組學技術進行多組學數據整合分析，為全面、深入理解乳腺癌的分子分型提供了新的視角，並確認了多種可介入治療的基因組異常位點和驅動腫瘤發生發展的重要節點。而RPPA檢測技術也在這篇文章中從科研幕後逐漸走到了臺前，漸漸被腫瘤科研界所知曉。

TCGA的蛋白組學分支，在MD安德森系統生物學系Gordon Mills教授團隊的帶領下，運用RPPA技術，通過對403例乳腺癌樣本中171個與癌症相關的蛋白及其磷酸化水平進行了相對豐度測定。這項分析在當時是納入樣本數最多、最大的一項乳腺癌分型蛋白組學分析，也因RPPA技術的加持，開創性的發現了一系列癌症系統蛋白組層面的新現象，並找到了多種潛在與藥物治療靶點、分子分型相關的蛋白組學信息，並關聯到其它驅動基因，關鍵位點和高頻突變。

研究團隊通過RPPA靶向蛋白組學分析，發現7個由蛋白組學定義的亞型。這些蛋白組定義的亞群與轉錄組分型高度一致，也驗證了轉錄組層面的信息可以很好地體現在蛋白組尤其是功能蛋白組層面。深入分析表明，尤其是在HER2過表達亞型中，蛋白組學的信息高度一致，同時也反映在HER2以及EGFR的豐度和磷酸化水平上。在管腔型乳腺癌中，RPPA蛋白組學發現了高表達的ER,PR,AR,BCL2,GATA3以及INPP4B，這些蛋白與管腔A型具有高度關聯。而在另一個由RPPA蛋白組學定義的組內，發現了高度異質性，這裡面包括了A/B兩種表型的樣本。這個組含有高表達的與腫瘤微環境相關的蛋白以及腫瘤相關成纖維細胞蛋白（ fibronectin, caveolin 1 and collagen VI.）。其中Reactive I型包含了大部分管腔A型，而Reactive II型包含了由RNA定義的各個亞型的混雜樣本。通過前期病理學驗證，這兩個組別間並沒有腫瘤細胞含量的顯著差異，也說明該分型的可靠性。通過兩個分子亞型的監督聚類分析，發現了在miRNA，DNA甲基化，突變，以及拷貝數變異層面無法將這兩個組別區分開，而在mRNA轉錄組層面有著一定的關聯。也證明了蛋白組層面信息，無論是在臨床分型，治療靶點探索中無可替代的重要性。（如圖3）。

圖3

RPPA蛋白分型，無監督聚類聚出兩種新的亞型，命名為Reactive I和Reactive II，對這兩者進行比較癌細胞幾乎沒有差別，而差異蛋白主要是由基質細胞或微環境分泌或導致的。

通過對同一樣本的多組學分析，研究者還發現了一些亞型相關的突變在蛋白組層面即存在一定的關聯性，也存在一定的差異性。如管腔A型中的高頻PIK3CA突變並沒有造成下遊通路蛋白的高度磷酸化（pAKT,pS6,p4EBP1）,而這個高頻突變在三陰性和HER2陽性乳癌中呈現出高度過表達。TP53通路 在luminal A亞型中很大程度上是完整的，在侵襲性更強的luminal B亞型中通常是失活的；RB作為抑癌因子，在lunimal亞型的mRNA和蛋白層面都有表達，尤其是luminal A亞型，因此該亞型的預後通常也是最好的。（圖4，圖5）

圖4

將高頻突變基因與mRNA表達譜的4種主要分析進行相關聯，發現每一種乳腺癌分子分型都有特定的高頻基因突變模式，並且 luminal A 和 luminal B具有更強的異質性，同時luminal A 亞型的基因突變率是最低的。

圖5

對 luminal/ER+亞型來說，PIK3CA突變頻率很高，並且從RPPA技術平臺的數據來看，該通路上的關鍵蛋白都沒有升高，說明在這個亞型中該通路是失活的；TP53通路 在luminal A亞型中很大程度上是完整的，在侵襲性更強的luminal B亞型中通常是失活的；RB作為抑癌因子，在lunimal亞型中mRNA和蛋白層面都有表達，尤其是luminal A亞型，因此該亞型的預後通常也是最好的。

研究者還根據基因及RPPA蛋白表達羅列出了一系列臨床藥物或在研藥物、抑制劑，包括了AKT1,PARP，FGFR,IGFR1以及cyclinD1，CDK4/CDK6等。這些靶點也在RPPA蛋白組層面得到了豐富信息，為藥物治療提供了基礎。

在臨床上，雖然已經驗證了HER2陽性與DNA拷貝數變異相關，但HER2陽性病人也不完全由HER2分子分型決定。通過RPPA及mRNA表達譜，研究者確認了分子型與臨床表型重合病人中的高度HER2/EGFR表達及磷酸化；利用蛋白表達分型，發現有50%的臨床HER2陽性類型屬於管腔型乳腺癌，也驗證了至少存在2中臨床亞型表徵，為治療提供了依據；而通過RPPA也發現了至少36種顯著差異蛋白表達，這為兩個臨床HER2表型的亞型的生物標誌物探索提供了新的思路。

這項開創性的多組學整合性分析，包括患者在基因與表觀層面的改變都能歸類到4種主要的乳腺癌分型中，不僅與基因組層面的趨同進化一致，就像在多種其他生物體中觀察到的一樣，而且也與乳腺癌克隆擴增和體內細胞選擇的模式相一致，該模式能夠用來解釋在特定乳腺癌亞型中觀察到的表型異質性（圖6）。而RPPA蛋白組學信息不僅提升了多組學整合性分析的潛力，也發現了全新的與分子分型，治療靶點相關的信息，為臨床轉化提供了更加強有力的證據（圖7）。

圖6

對6種技術平臺數據進行整合分析發現，mRNA、RPPA與共分析分型有很強的相關性，說明其他幾種信息量，包括像DNA拷貝數異常、DNA甲基化等都能夠從基因表達層面與蛋白功能層面獲取。

圖7

多平臺數據總結及信息整合，大大提高了我們對乳腺癌分子分型的認識。

總結

該文是RPPA蛋白組學領域的開山大作，闡明了RPPA技術能夠提升多組學整合性分析的潛力，是一種功能強大的系統蛋白組學分析方法，隨之被應用多個TCGA泛癌項目中，開闢了一個新的蛋白組學應用場景，並且已被廣泛應用於研究腫瘤起始/進展及生物標誌物開發和藥物機制研究。RPPA技術作為一種開源的技術，根據需求可以實現幾十種至幾百種蛋白質靶點及翻譯後修飾靶點的豐富分析，而主要應用方向則涵蓋了關鍵的癌症信號通路及轉導途徑（如圖8）。

圖8

RPPA系統蛋白組學靶點示例圖

這種分析方法的獨特性，在於能夠同時分析成百上千種樣本（細胞或組織裂解物），並進行平行蛋白組學差異表達比對分析，包括其活化水平，例如磷酸化、甲基化、乙醯基化等，且具有其它高通量蛋白組學所不具備的定量優勢。

杭州紐藍科技有限公司是一家實驗室科學儀器及技術綜合解決方案供應商，專注於醫學、和製藥領域，同時擁有自主研發的NeoSPR無標記分子互作產品及檢測服務。紐藍科技旨在推動RPPA技術在國內的應用和發展。紐藍科技代理美國Quanterix公司的全球首款實心針高通量微陣列列印儀2470Arrayer在中國區的銷售的技術支持。2470 Arrayer的實心針列印方式實現了對細胞或組織裂解液等粘稠度很高的樣品即快速又精確的列印，已經幫助MD 安德森癌症中心、德國癌症中心、神奈川癌症中心、芬蘭癌症中心、喬治梅森大學、貝勒醫學院等機構搭建了RPPA技術平臺並得到了廣泛的使用，發表了300餘篇高水平的期刊。

非因生物作為杭州紐藍科技有限公司的合作夥伴，傳承MD安德森癌症中心的價值和理念，在濟南建設了以Gordon B. Mills 博士命名的Mills癌症個體化診療研究中心(Mills Institute for Personalized Cancer Care, MIPCC)，並嚴格按照MD安德森的水準搭建了中國第一家RPPA蛋白組學平臺，基於RPPA蛋白組學技術平臺，可分析培養細胞、小鼠模型組織、及臨床病人樣本（鮮凍樣本）中超過300種癌症相關蛋白及蛋白修飾位點，覆蓋幾十個癌症相關的重要信號通路，提供蛋白組學大數據的基本生物信息學分析和解讀。

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