NCB | 細胞衰老中細胞核自噬底物新成員——SIRT1

責編 | 兮

Sirtuins是NAD+依賴性脫乙醯基酶和ADP-核糖基轉移酶在進化上保守的家族，在廣泛的生物活性中起重要作用。在哺乳動物的sirtuins中，SIRT1是最受關注的成員之一，並且它是多種細胞和機體過程的調節劑，包括新陳代謝，免疫應答和衰老【1】。酵母中SIRT1同源物Sir2的水平在複製性老化後下降，這是酵母老化的原因之一【2】。然而，在哺乳動物衰老過程中SIRT1蛋白穩態的調節機制仍不清楚。由於SIRT1功能的重要性，之前研究多集中於提高SIRT1的催化活性，但對SIRT1在蛋白質水平上的穩態卻知之甚少。

近日，來自賓夕法尼亞大學的Shelley Berger課題組和哈佛大學Zhixun Dou課題組在Nature Cell Biology雜誌上發表了題為 SIRT1 is downregulated by autophagy in senescence and ageing 的研究文章，揭示了調控核內SIRT1蛋白通過自噬降解的機制，並提出了穩定SIRT1促進生產老化的潛在策略。

作者首先研究了哺乳動物衰老和老化中的SIRT1動態平衡。細胞衰老(senescence) 是一種由端粒縮短或細胞應激誘導的細胞周期停滯的穩定狀態。老化的組織通常以衰老細胞的累積為特徵。清除衰老細胞可延緩與年齡有關的病理學，這表明細胞衰老與機體衰老之間存在關鍵聯繫。作者發現在多種衰老細胞模型中SIRT1蛋白水平均隨著衰老過程逐漸降低，相反，SIRT1蛋白的水平在接觸抑制誘導的靜息狀態（quiescence）下保持不變，這表明SIRT1蛋白在細胞衰老過程中的丟失是特異的。

雖然在細胞衰老過程中，SIRT1的蛋白水平降低，但相應的mRNA的水平並未降低。這表明除了調節mRNA合成或穩定性外，其他機制還主要參與細胞衰老過程中SIRT1蛋白穩態的調節。於是作者進一步探究在蛋白水平的調控機制，發現SIRT1蛋白的下調並不是通過蛋白酶體介導的降解，而是通過溶酶體降解。

自噬是一種膜運輸依賴的途徑，通過自噬體和溶酶體降解細胞成分。之前的研究主要集中在自噬對細胞質內成分的降解，但對自噬在細胞核內的作用機制的探索較少。作者發現在細胞和機體衰老過程中哺乳動物SIRT1蛋白的下調是通過SIRT1與自噬蛋白LC3的相互作用，並進一步通過細胞質自噬體-溶酶體降解。免疫螢光染色顯示，儘管SIRT1主要位於增殖細胞核中，但在衰老細胞中觀察到細胞質SIRT1 puncta，並且細胞質SIRT1 puncta 與LC3共定位。LC3是識別和將底物轉運至自噬體所需的自噬蛋白。然後，作者構建了mCherry-GFP-SIRT1載體來研究SIRT1的自噬運輸。由於GFP對低pH值敏感，因此標記蛋白中mCherry信號代表了在酸性自溶酶體和溶酶體中的定位。在增殖細胞中表達的mCherry-GFP-SIRT1主要是核定位，並帶有雙色合併後顯示的黃色。相比之下，衰老細胞則顯示出僅與LC3或LAMP1共定位的胞漿紅色SIRT1 puncta（圖1）。用Lys05中和溶酶體pH可以防止衰老細胞中mCherry-GFP-SIRT1蛋白從GFP淬滅，並導致其融合的黃色信號保留在細胞質中，進一步表明溶酶體靶向細胞質SIRT1降解。總之，這些結果表明，核SIRT1在細胞衰老過程中經歷了細胞質自噬-溶酶體降解。

圖 1 SIRT1在分裂和衰老細胞中的定位。

接下來，作者研究了SIRT1中與LC3相互作用的區域，首先使用一種肽陣列（peptide array）方法在SIRT1中鑑定了可能與LC3相關的八個區域。為了縮小關鍵目標，作者通過將大約30個胺基酸的合成肽添加到SIRT1-LC3的 IP分析中進行了肽競爭IP，從而確定了三個目標LIR / LIR樣基序（圖2）。作者進一步在全長SIRT1中替換了三個LIR / LIR樣基序的各個關鍵殘基，並在LC3和全長SIRT1突變體之間進行了IP ，發現了W221A和V224A雙重突變導致了與LC3的相互作用減弱，而其他兩個基序-F474A，D475A和V476A三重突變以及Y497A和L500A雙突變不影響LC3結合。關鍵的LIR基序（221–224）位於SIRT1的N端區域，該基序的N末端殘基突變體E214，D216和D217也損害了LC3結合。此外，在跨越胺基酸位置205-233的合成肽上引入WV突變顯示出與全長SIRT1-LC3相互作用競爭的能力受損。這些結果表明，SIRT1上的221-224區對於SIRT1-LC3的相互作用至關重要。

圖2. 肽陣列鑑定SIRT1-LC3相互作用區域

為了檢驗這個通路的生理意義，作者通過體內實驗表明在衰老過程中自噬-溶酶體途徑會導致與免疫和造血系統相關的多種組織SIRT1的喪失，這些組織包括小鼠脾臟，胸腺，造血幹細胞和祖細胞以及老年人類來源的CD8+ CD28-T細胞。

因此，SIRT1蛋白水平的恢復可能提供了延緩免疫老化和衰老的關鍵手段，為潛在的治療幹預提供了新思路。另外，穩定SIRT1蛋白水平（例如通過中斷SIRT1-LC3相互作用）可能是抗衰老化合物設計的新方向。

除了核纖層蛋白B1 （Lamin B1）【3】，SIRT1是目前報導的LC3介導的選擇性自噬的第二個主要核底物，這表明核自噬途徑可能在細胞生理學中具有普遍的作用。未來的研究需要探索是否有更多的核自噬通路底物，並解答生物體如何調控核自噬通路底物的選擇性或特異性的分子機理。

據悉，賓夕法尼亞大學Caiyue Xu博士和博士後Lu Wang為本文的共同第一作者。賓夕法尼亞大學Shelley Berger和哈佛大學Zhixun Dou為本文的共同通訊作者。

哈佛大學Zhixun Dou課題組計劃深入研究核自噬在細胞和機體衰老的作用和機制，目前正招收博士後研究員，詳見實驗室主頁https://www.zdoulab.org 。

原文連結：

https://www.nature.com/articles/s41556-020-00579-5

製版人：十一

參考文獻

1. Haigis, M.C. & Sinclair, D.A. Mammalian sirtuins: biological insights and disease relevance. Annu Rev Pathol 5, 253-295 (2010).

2. Dang, W. et al. Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan.Nature 459, 802-807 (2009).

3. Dou, Z. et al. Autophagy mediates degradation of nuclear lamina. Nature 527, 105-109 (2015).