來源：生物催化劑設計與改造服務微信公眾帳號 發布者：管理員 日期：2015-09-22 今日/總瀏覽：1/4946
鳥氨酸是胺基酸中間體，也是重要的醫藥原料和天然產物合成前體。2015年9月8號，Nature communication發表了江南大學和Jens Nielsen實驗室構建鳥氨酸高產酵母的研究成果，工程酵母補料發酵可產鳥氨酸5.1 g/L。
作為食品添加劑和醫藥分子，穀氨酸棒桿菌無疑是最好的鳥氨酸（L-ornithine）細胞工廠，文獻報導鳥氨酸的補料發酵濃度可達到40 g/L以上。作為天然產物（如莨菪烷生物鹼，tropane alkaloids）合成前體，考慮到合成必需的P450氧化還原酶很難在細菌中表達，釀酒酵母則較穀氨酸棒桿菌更適合。而倘若工業化來生產這樣的天然產物，直接補加較廉價的鳥氨酸似乎更合適。無論如何，這是首次報導構建高產胺基酸中間體的釀酒酵母，對其他類似產物細胞工廠的改造具有借鑑意義。
這裡研究者應用模塊化途徑重構策略（modular pathway rewiring strategy，MPR）來提高葡萄糖到鳥氨酸產量。整個改造策略分為3個模塊，1）鳥氨酸消耗模塊；2）鳥氨酸合成模塊；3）前體供應模塊，即α-酮戊二酸合成模塊。
模塊1
1）鳥氨酸消耗模塊 改造該模塊的目的是減少鳥氨酸向精氨酸、穀氨酸的轉化，增加鳥氨酸的累積。下調鳥氨酸氨甲醯轉移酶基因ARG3（弱化精氨酸合成），敲除鳥氨酸氨基轉移酶基因CAR2（阻斷鳥氨酸轉化為L-穀氨酸-γ-半醛）獲得工程菌M1c積累45 mg/L的鳥氨酸。
模塊2
2）鳥氨酸合成模塊 改造該模塊目的是增加α-酮戊二酸向L-鳥氨酸的合成通量。考慮α-酮戊二酸在胞質中合成，而鳥氨酸在線立體中合成，因此這裡有3種方法：
①不改變α-酮戊二酸或鳥氨酸的亞細胞定位。過表達精氨酸合成基因ARG5,6、ARG7、 ARG8，乙醯鳥氨酸合酶ARG2、線粒體膜上鳥氨酸轉運體ORT1和精氨酸轉運體AGC1，胞質中穀氨酸脫氫酶GDH1的工程菌M1cM2I可積累173 mg/L的鳥氨酸。
②將α-酮戊二酸合成轉位到線立體，即在線粒體中引入穀氨酸脫氫酶，但穀氨酸在線粒體環境合成很少使該策略失敗。
③在細胞質中重構鳥氨酸合成途徑。通過在胞質中引入大腸桿菌來源的argAEC、argBEc和穀氨酸棒桿菌來源的argJCg、argCCg和 argDCg，同時過表達ORT1、AGC1和GDH1的工程菌M1cM2q可積累173 mg/L的鳥氨酸。說明在胞質中重引入完整的鳥氨酸合成途徑比改造內源途徑更適合於鳥氨酸的積累。
3）前體供應模塊 目的是增加前體α-酮戊二酸供應，增強流向鳥氨酸合成的代謝流。這裡研究者也採用了3種方法。
①過表達TCA循環中合成α-酮戊二酸相關的基因PDA1, PYC2, CIT1, ACO2 和 IDP1，工程菌M1cM2qM3a可積累245 mg/L的鳥氨酸，通過控制葡萄糖濃度的補料發酵可使鳥氨酸濃度達到5.1 g/L。
②過表達異源NADH氧化酶HaAOX1和內源的NADH脫氫酶NDI1可達到與直接增強TCA循環酶一樣的效果，工程菌M1cM2qM3d可積累278 mg/L的鳥氨酸。
③通過過表達調控基因MTH1-△T降低糖轉運體表達的工程菌M1cM2qM3e可積累778 mg/L的鳥氨酸，進一步過表達精氨酸合酶CAR1獲得M1dM2qM3e可批次發酵產精氨酸1.041 mg/L。葡萄糖吸收速率降低導致菌株生長很差，弱化了代謝流流向乙醇合成（Crabtree effect），使這樣的菌株並不適於工業化生產。
這是第一次構建釀酒酵母高產胺基酸中間體的細胞工廠，對其他類似中間體及其衍生化學品（天然產物）釀酒酵母細胞工廠的構建具有借鑑意義。
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