任麗麗:新型冠狀病毒病原學研究對臨床的提示

有關新冠病毒病原學存在的許多未解問題，目前還無法給出一個100分的答案。今天主要和大家交流新冠病毒從病原學的角度進行了哪些研究，這些研究給臨床帶來哪些提示，特別提到的是在病毒檢測方面如何選擇方法。從2005年開始，國內團隊開展了系統的呼吸道病毒病原學研究，積累了核酸、抗體等檢測方法和經驗，在新冠病毒檢測中這些技術能夠在病原鑑定和病原學研究中充分發揮作用。

一、它是誰？

病原學的問題可總結為「六大問題」。第一個問題，它是誰？當發現一個不明原因肺炎或者其他的不明原因感染，它到底是由什麼病原引發？

把發現過程整理成文章是重要的「復現」過程，實際上是展示完整的鏈條——如何確定新冠病毒就是疫情的病原體。這四篇文章中除了有一篇在早期發表，其他三篇文章都是按照要求在1月20日之後發表在各個雜誌。當時國內有幾個團隊按照任務要求同時開展鑑定工作，很快就都鎖定了一種新型冠病毒為此次疫情病原。知道它是誰，那麼病毒通過何種方式感染細胞？感染哪些組織細胞？病毒傳播過程中如何變化？人感染之後的症狀是什麼樣？如何防治？我們針對上述幾個問題逐一探討。

二、新型冠狀病毒的發現

十餘年前，當我們遇到不明原因肺炎等疾病時，鑑定病原常是猜測排除法。近些年，分子檢測技術不斷發展，未知病原鑑定技術體系隨之不斷完善，如此次鑑定新冠病毒鑑定的團隊均採用不同的深度測序技術快速獲得病毒的基因組序列，結合病毒學經典的技術方法，即病毒的分離培養、病毒抗體和抗原等免疫學特徵等來確定新冠病毒是感染病原體。體現在新冠病毒鑑定的文獻裡，能看到基因組序列特徵、分離的病毒引起的細胞病變效應、病毒在電鏡下的形態學特徵，人體特異性抗體的產生等結果為鑑定依據。其中感染病例血清抗體特徵以外周血抗體4倍增高為依據來判定是否有病毒感染等。這些方法都是病毒病原學研究常用的檢測方法，在所有檢測鑑定方法中分子檢測仍是較快速的，可以幫助我們快速病毒篩查；病毒分離培養等病毒學上的「金標準」檢測方法耗時長。

新冠病毒發現以後，從感染症狀上來看，部分病人會出現嚴重急性呼吸症候群（SARS），據此命名為SARS-CoV-2。根據基因組序列特徵，新冠病毒的組成與SARS等冠狀病毒家族成員比較接近，從5'端開始前2/3的區域都是編碼病毒聚合酶的基因，後1/3是編碼包括刺突蛋白（Spike, S）、包膜蛋白（Envelope, E）、膜蛋白（Membrane, M）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid, N）等病毒主要結構蛋白，在這些結構蛋白中穿插著小的開放讀碼框編碼非結構蛋白，這些非結構蛋白是拮抗宿主天然免疫反應，誘導宿主焦亡或者凋亡的重要蛋白分子。

驗證滿足Koch法則

從發現新冠病毒以後，我們會看到很多通過自媒體或官方媒體等渠道發布的信息，如「某地方測了一條序列，已經證實為××」，這是非常不嚴謹的說法。要證實一個新發疾病病原，不是有點序列就可以判斷，即使從基因組特徵確認了新型冠狀病毒基因序列的存在，判定其為感染病原但仍需遵循科赫法則。

對於新冠病毒來講，我們團隊與中國醫學科學院醫學實驗動物研究所的老師合作，很快就把這一條鏈條形成一個閉環的證據全部拿到。從基因組與生物信息學的角度來看，我們知道這是冠狀病毒序列，在細胞上分離出來新冠病毒，也可以明確其冠狀病毒的形態，那它到底是不是致病病原呢？

這組實驗，是在前面已經確定病毒基因組特徵、分離到病毒的情況下，用病毒分離株感染轉人類ACE2基因小鼠（hACE2小鼠），能夠看到實驗小鼠體重下降，肺部炎症的表現，病毒S蛋白和hACE2受體被發現共定位於肺泡上皮細胞，最關鍵的是從小鼠的感染組織中分離出新冠病毒，經過基因組測序與感染的毒株序列基本一致。這個過程在文章中是很簡單的一張圖片，但拿到一張滿意的圖片難度還是比較大，記得負責電鏡檢測的老師用了一個通宵拿到這張圖片。上述提到的四點就是經典的科赫法則，我們把鏈條完美地呈現出來，就可以確定它就是導致新冠肺炎的病原。

第七個可感染人冠狀病毒

上圖為感染人類的冠狀病毒的家族譜，圖中紅字都是可感染人冠狀病毒。從1966年人冠狀病毒229E和1967年人冠狀病毒OC43發現以來六十餘年時間，我們只認識2種可感染人冠狀病毒。2003年的SARS-CoV出現，SARS之後的2004年，港大的袁國勇教授以及荷蘭的學者發現兩個新型可感染人冠狀病毒，即HKU1、HCoV-NL63。隨後，又過了約8年的時間，在2012年發現了MERS-CoV。在2019年，又出現了SARS-CoV-2。所有的人類冠狀病毒都是跨種來源。2003年後由於溯源需要，在蝙蝠等野生動物體內鑑定出多種動物冠狀病毒，能否從動物體內早期鑑定出可能感染人類的病毒，這是病原學研究中重點關注的內容。積累的冠狀病毒基因組特徵等數據也為後續尋找病毒演化特徵提供了必備的基礎參考數據。

新型冠狀病毒形態

表面是冠狀的皇冠樣的結構。

在細胞裡面會形成大量的囊泡樣的狀態。其實很多冠狀病毒都會形成這樣的囊泡樣結構，這種囊泡的結構與病毒的致病機制密切相關。但是這方面的研究起步比較晚，現在還沒有太大的進展。

病毒結構與功能

從公開發表的文章時間軸上可以看到，首先我們要清楚新冠病毒如何感染人類，找到受體是我們做病原學研究中首要完成的工作。從早期發表的病原發現的文章中，對基因組特徵的描述上，可從基因組成結構特徵上預測受體類型，預測到新冠病毒可能會利用ACE2感染人類。很快國內的幾個團隊背靠背解析出這個結構，明確新冠病毒的受體就是ACE2，同時也都知道了TMPRSS2（跨膜絲氨酸蛋白酶）所起的作用。那麼，新冠病毒是否存在其他的人體受體？

新冠病毒引起的腸道反應是既往在人感染冠狀病毒中一直存在的，比如感染新冠病毒後引起的腹瀉等。基於腸道類器官開展新冠病毒感染的研究，發現CD147可能是新冠病毒的受體，細胞實驗發現阻斷CD147可抑制病毒在腸道細胞和肺、肝臟、皮膚等來源的細胞上的複製。

新冠病毒感染細胞系

病毒感染不同組織來源的培養細胞系，如果能形成有效的感染，提示其可能在人體感染過程中攻擊相應的組織器官。這是做病毒病原學研究的關注點之一，體外細胞培養結果與人體組織細胞的嗜性並不是完全的一對一的關係，但至少會給我們一個提示可能的器官嗜性。

新冠病毒可以在肺腺癌Calu3細胞、腸腺癌的Caco2細胞、肝細胞癌的Huh7細胞上複製，還可以在腎臟細胞、神經系統來源的細胞上複製。這些容許新冠病毒複製的細胞，高度提示其在人體感染過程中的器官嗜性，對於理解病毒致病機制有重要提示作用。

組學技術手段的應用也進一步加速了對新冠病毒感染特徵的認識，如大規模的單細胞測序、轉錄組測序、蛋白質組學篩選等方法，使我們能夠在第一時間獲得更全面數據來幫助我們去重新認識新冠病毒對人體感染的特點。這篇文章對36個組織進行轉錄組分析，分析哪些組織同時表達ACE2和TMPRSS2。表達豐度從高到低排序，肺部的AT2細胞、巨噬細胞等表達量較高。

此外，在全身的各個組織臟器上也都分布有這兩種病毒複製相關的關鍵宿主因子，如心肌細胞、腎上腺和睪丸的基質細胞等。大數據線索還有哪些提示呢？病毒使用的受體也是人體生理活動下必需的宿主因子，受體高表達區域可能對病毒嗜性器官具有提示作用，但需要注意細胞類型和組織分布部位，是否自然感染狀態下病毒能夠直接接觸到這些細胞。此外，要考慮是否有病毒血症，病毒可通過二次體內分布攻擊各個器官。COVID-19病人臨床表現具有心臟受損、腎臟受損等多器官功能損傷，重症病人血液中可檢測到病毒核酸，提示存在病毒血症，而上述容易出現功能受損器官的組織細胞上有ACE2等受體的表達，提示病毒可能通過血液、體液等導致全身多臟器的直接損傷。

對ACE2等受體分布特徵的研究也外展到寵物、野生動物、家禽等不同物種，對病毒受體表達特徵的研究，發現貓的AT2細胞、成纖維細胞、杯狀細胞等都有受體高表達，寵物貓在病毒傳播中的作用還需要深入研究，僅僅通過受體分布特徵的數據還不能提供更多的證據。除了表達水平，後續要關注不同物種ACE2受體結構上的差異。

有研究提出44種哺乳類動物的ACE2可介導新冠病毒進入靶細胞，還發現了不同種類的猴子的反應都不太一樣，如新世界猴ACE2不支持病毒進入細胞。這些數據提示高表達病毒受體的物種在病毒自然傳播中的潛在作用。進一步仍要深入對ACE2關鍵功能位點的解析，更有助於我們認識新冠病毒的跨物種感染。

三、怎麼檢？——檢測方法

新冠病毒對人群是普遍易感的，怎麼能更快找到感染的病人，也就是要採用什麼檢測方法？現有的檢測技術包括檢測病毒顆粒，檢測病毒蛋白和遺傳物質（核酸）以及檢測病毒感染之後人體的反應。隨著方法學上的不斷改進，我們能夠更快、更靈敏和特異的檢測方法。

檢測病毒有哪些常用的方法？

第一，病毒的分離，是病毒檢測的金標準。用動物、培養的組織細胞培養、雞胚等接種樣本進行病毒的分離。但是病毒的分離是高技術依賴性，依賴於樣本質量、病毒嗜細胞性以及分離體系，因此病毒分離是領域內重點發展的一個方向。新冠病毒可採用3D培養細胞系、非洲綠猴腎細胞（Vero和Vero E6）分離培養。

第二，血清學方法，包括中和試驗、補體結合試驗、紅細胞凝集/抑制試驗等，檢測病毒蛋白和宿主感染後的病毒特異性抗體；現代發展的免疫學分析方法，包括酶聯免疫和免疫螢光方法等，檢測病毒抗原、IgM和IgG抗體等是對經典血清學方法的補充。這些方法具有較強特異性，但敏感性不足。其中，中和試驗是判斷病人是否產生能夠中和病毒的抗體，需要使用活病毒，在生物安全III級實驗室操作。

第三，分子生物學技術，新冠疫情讓大家熟知的聚合酶鏈反應（PCR技術）就是常用的核酸分子生物學技術，此次病毒鑑定使用的高通量測序方法也是當前病原學檢測上應用的技術。

第四，電鏡技術，用於病毒形態學鑑定和觀察，高技術依賴性，需要電鏡設備。

這些檢測方法各有優缺點，在方法學的使用上要根據實際情況選擇。雖然我們做了很多年的病毒病原學研究，做了大量的核酸檢測，但是做呼吸道病毒的核酸檢測，既往在三甲級醫院等醫療機構並沒有實現常規檢測。在當前常需要進行核酸大規模檢測情況下，應高度關注核酸氣溶膠汙染，這對於實驗室空間要求和個人技術能力等的要求很高。發展通量自動化核酸提取和檢測平臺，推進非核酸提取方法的封閉式的快速檢測平臺都是核酸檢測方面亟待發展的內容。希望這次的新冠疫情能夠作為一種助力，推動快速檢測技術的發展。

監測病毒基因組的突變

病毒核酸檢測要求檢測引物（探針）序列與病毒基因組序列的匹配，新冠病毒的基因組為RNA，在自然演化和在群體免疫壓力下是不斷發生適應性突變。在國家基因組科學數據中心和國際多個數據網站上都可實時更新基因組突變情況。監測突變可以幫助我們去發現檢測核酸的引物靶向基因區域是否發生突變，會不會容易產生脫靶的現象。毒株序列在其流行早期被分為S和L型，2020年1月7日前後，在武漢和非武漢地區S型別的分布呈現顯著差異；經過全球近半年的流行適應，核蛋白基因R203K和G204R的突變株在全球多地出現；刺突蛋白基因D614G的突變株逐漸成為主要流行毒株，這一毒株被認為具有更快的傳播能力。因此，對突變的監測不僅對檢測方法的優化有重要作用，更是發現新的傳播特性毒株、評估病毒流行特徵的關鍵。

對突變的監測也可以從人體內突變分析角度來進行。群體中出現的突變病毒基因組，是病毒在個體內複製和群體間傳播選擇過程中逐漸形成的優勢毒株。病毒人體中每複製一次，會產生0.01~0.0001個位點出現突變，這種突變與病毒聚合酶糾錯功能不足和個體免疫壓力的選擇有關。因此，每個病人體內帶有具有不同突變位點的基因組序列，稱之為病毒準種。個體內不斷選擇形成的最有複製和傳播優勢的毒株逐漸形成了群體優勢毒株。因此，對新冠病毒的宿主體內的突變監測，可有助於對群體流行株突變演化提供參考數據。

基於體液免疫反應特點建立檢測體系

抗原交叉反應分析

核酸檢測並不是完美的，受到了很多因素的制約，如樣本採集的質量、儲存運輸溫度和檢測靈敏度等，還受到不同感染病程的影響。基於此，我們團隊較早提出聯合應用IgM抗體檢測提高感染病例的檢出氯。建立抗體檢測方法需要要先找到特異性的抗原，這個抗原不能與其他病毒抗體有交叉反應，否則就不知道檢測出來的抗體是A病原引起，還是B病原引起。經過分析，發現新冠病毒只和SARS的N蛋白有反應，但是當年在SARS期間只感染了8000多人，而且他們不可能是IgM陽性了。所以當時我們用N蛋白去檢測IgM的抗體。隨後方法學上的不斷積累發現聯合N和S蛋白能夠進一步提高靈敏度。因此，對於核酸檢測陰性的病例，聯合檢IgM抗體分析，有助於發現早期感染病例。

SARS-CoV-2感染患者抗體特徵

血清IgM、IgG抗體檢出率與PCR陽性率

從抗體的流行特徵上來看，如圖所示，黑線是PCR檢出的陽性率，紅線是IgM的檢出率，綠線是IgG的檢出率。症狀出現後1~3天時，PCR陽性率為>90%，6天時下降到80%以下，14天時下降到50%以下；前5.5天，PCR法的陽性檢出率高於IgM ELISA法，而在症狀出現5.5 d後，IgM ELISA法的陽性檢出率高於PCR法。

抗體檢測輔助COVID-19診斷

左圖顯示的是在PCR檢測陽性的患者中，IgM陽性的患者佔75.61%，陰性佔24.39%；在PCR檢測陰性的患者中，IgM檢出率達到了93.1%。同時對病人開展PCR和IgM ELISA檢測，陽性率可以達到98.6%。這是針對武漢最早期的那一批病人的數據，我們在針對不同的感染時期，病人的特點和人群的特點，這種方法對提升檢出的比率要重新評估。

四、為何不同人感染後症狀不一——致病性

疾病表型多樣

我們已知人冠狀病毒的感染特點是輕症或無症狀，主要引起呼吸道感染、乾咳等，也有胃腸道症狀等，偶可導致重症呼吸道感染等。但新冠病毒引起的COVID-19疾病表型多樣，會引起多系統受累，結膜炎、皮疹、水腫等症狀，在兒童還可導致川崎病。因此，新冠病毒對於我們而言的確很「新」，作為臨床醫生還是要很細心地觀察病人，尤其對於新冠病毒核酸檢測陽性的病人，把他的症狀、體徵做好記錄，這對我們更深刻地認識新冠肺炎非常有幫助。對於我們做基礎研究或者做病原學研究的人來講，很期待能看到臨床方面系統的疾病類型總結。

為什麼不同人群感染新冠病毒的症狀不同，這是個比較難回答的問題。一般來說，感染後症狀的輕重要從病毒和宿主這兩個角度考慮。在早期，病毒突變沒有那麼強，病人感染的毒株幾乎都是同一個來源的毒株時，更多的要從宿主的角度來考慮。上圖是我們利用病毒感染的病人的BALF做的轉錄組，相比SARS-CoV，SAR-CoV-2誘發了更為顯著的IFN反應，在COVID-19病人BALF中，檢測到大量幹擾素誘導基因的表達。病毒感染人體產生的大量炎症因子，引起的免疫病理反應被認為是組織器官損傷的重要機制。

病毒感染細胞後的免疫反應

免疫病理損傷與炎症過度激活有關。目前認為病毒感染表達ACE2/TMPRSS2的細胞，使宿主細胞發生裂解並釋放損傷相關的分子模式（ATP，核酸，ASC低聚物），被鄰近的上皮細胞、內皮細胞和肺泡巨噬細胞識別，觸發促炎性細胞因子和趨化因子的產生（IL-6，IP-10，MIP1α，MIP1β，MCP1），將單核細胞、巨噬細胞和T細胞吸引到感染部位。在臨床上會使用細胞因子檢測試劑盒，在血中或者在呼吸道樣本體液中檢測出的細胞因子就是這樣的方式產生的。部分細胞因子的改變與疾病的嚴重程度呈現關聯性，藉此可提出相應的治療策略，如用白介素6拮抗劑來限制炎症損傷等。對病毒誘發炎症因子、其調控宿主信號通路關鍵因子的識別，有助於為抗病毒感染提供更多的靶點。

宿主易感性

遺傳易感性被認為與COVID-19嚴重程度有關。研究較多的包括幹擾素誘導穿膜蛋白3（Interferon-induced transmembrane protein-3（IFITM3）和TMPRSS2等。

IFITM3與COVID-19嚴重程度關聯

一項基於80個病人的研究發現IFITM3的RS12252位點發生CC的純合的變化在重症和死亡病例中的比例更高。另一項研究發現，IFITM2和IFITM3轉染細胞後能夠很好地抑制新冠病毒的複製。這些研究從宿主角度給出疾病重症關聯的影響因素。

TMPRSS2 突變與 COVID-19 嚴重程度的關聯

這項針對TMPRSS2的突變體開展的研究，在義大利人群中發現TMPRSS2的突變體與疾病的嚴重程度有關。雖然這些數據的人群數比較小，但還是能夠給我們提示遺傳易感性到底在急性病毒性感染中起什麼作用。急性重症呼吸道感染的遺傳易感性一直是領域內難以回答的問題，主要原因是病例入組難度大。在新冠疫情中，全球科學家針對易感性的問題在不同地域開展的同質化研究，有助於在更多的病例數量基礎上揭示宿主基因突變與病毒感染及疾病嚴重程度的關聯。

近期，英國將要開展一項約2萬個病例的遺傳易感性研究，國內的一些小規模的數據可能即將公布，數據的積累有助於推進未來個體化醫療。

病毒感染的不同階段，如何把研究中發布的數據與臨床的症狀和體徵結合起來，在防治的角度尋找一個切入點，這一點是單純依靠研究人員是無法完成的，需要大家的合作與交流。

五、到哪去？——演化突變

基因片段缺失和點突變

前文我們提到監測基因組突變在優化檢測方法中的作用，也提及新的突變形成的主要流行株傳播力的改變。對突變特徵和突變後毒株傳播致病等特點的認識，也就是對其演化方向和特徵的了解對於疫情防控非常關鍵。病毒基因突變包括基因片段的缺失和點突變。當前病毒基因組數據比對可以看到 ORF 8區域 382nt缺失和美國出現的ORF7a 81nt缺失。這種缺失突變株導致病毒毒力減弱。

現在大家最關注的突變熱點就是S基因的D614G突變，突變病毒株在全球已經成為主要流行毒株。目前在細胞學水平的研究可見D614G突變能毒株病毒表面的S蛋白增多，同時病毒穩定性增強，它感染人源細胞的能力增強。614G位點突變在群體中的傳播力是不是也會更強，需要流行病學的數據來幫助佐證。對於病毒的演化來說，我們即使不知道它的來源，但至少密切關注它的突變對人類的影響有多大。

防和治

藥物、疫苗、治療性抗體等防治方法的研究和建立從新冠疫情開始即在全球多個基礎和臨床的研究組展開。對FDA批准藥庫的篩選，找老藥；從轉錄組、蛋白質組不同層面揭示病毒和宿主細胞蛋白因子相互作用圖譜的繪製，篩選新的藥物作用蛋白靶點，這些工作為抗新冠病毒有效安全藥物的發下提供了大量可參考的數據。

在過去的半年中，一些中藥、克立芝、瑞德西韋等臨床實驗陸續開展，雖然沒有達到大家預期的完美結果，但積累的經驗為我們後續研究工作提供很好的基礎依據和提示。

六、從哪裡來——起源

跨種病毒的溯源問題很難回答。對SARS冠狀病毒的溯源我們用了十幾年的時間，有很多團隊非常努力工作，一點一點去尋找線索。對於MERS來講，因為有SARS的相關經驗，尤其是MERS的流行比較局限於中東地區，所以推斷起來相對來說比較容易。

但是對於新冠病毒，雖然基因組證據提示新冠病毒可能來自於蝙蝠，但是否有中間宿主，是哪種動物仍然不明確。部分人就認為穿山甲可能扮演了中間宿主角色，但是依據仍不充分。因此，對於新冠病毒起源的確定還需要有大量的工作。

是否存在中間宿主？突破種屬屏障的分子機制？

新冠病毒如何突破種屬屏障機制不清。已知人類的冠狀病毒中間宿主可能經歷了羊駝、豬和駱駝等，而新冠病毒的中間宿主尚不十分明確。對宿主適應性的研究，是基於禽流感病毒的研究進展較快，以下以禽流感病毒為例說明。

宿主的適應：以流感病毒為例

病原從野生動物到中間宿主到人身上適應的過複雜。以流感病毒為例，我們身體裡面的宿主因子ANP32A決定禽流感在人類的適應性，正常情況下，禽類的病毒在人體細胞上不太容易複製，這就是宿主的天然屏障。但是病毒就是一個點的突變，就會突破宿主屏障。對於宿主適應性的演變，也有可能幫助我們去找到它的源頭，比如聚合酶活性的調適、受體的適應、宿主限制因子的突破等。

近十餘年來，引起重大公共衛生事件的新發突發病毒多來源是野生動物，未來我們遇到這種跨種來源病原影響的風險會持續存在。因此，不論是做疾病防控，還是臨床工作；不論是醫生，還是研究人員，始終要繃著一根弦，那就是考慮接觸到的不明原因感染事件是否為新發病原引起。新冠病毒是近百年來人類面臨的相當於一次災難性事件，是否會有同類病原跨種仍是未知。對於現場的臨床醫生，在門診上看到了一個不明原因發熱的病人，明確感染病原實現精準治療對於早期發現新發病原是非常關鍵的。用合適的方法鑑定出病原，用更可靠的手段去明確它的傳播力，把信息迅速和大家共享，合作共享有助於能夠找到更好的防治方法。這一點是我今天特別想傳遞給大家的一個信息。

新冠病毒資源共享

> 2019 Novel Coronavirus Resource (2019nCoVR). Data, tools, literature

https://bigd.big.ac.cn/ncov/?lang=en

> SARS-CoV-2 Genome Sequencing Data DNA Sequencing：Data https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/

> SARS-CoV-2 Transcriptomic Map RNA Sequencing Data：Open Science Framework: accession

number doi:10.17605/OSF.IO/8F6N9

> SARS-CoV-2 and Human Protein Interactions Mass Spectrometry Raw Data：http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset?ID=PXD018117

> SARS-CoV-2 Strains Genomic Epidemiology：

https://nextstrain.org/ncov， https://www.gisaid.org/， https://bigd.big.ac.cn/ncov

> The COVID-19 Host Genetics Initiative Host Genetics Data(GWAS, WES, WGS https://www.covid19hg.org/

> List of Clinical Trials Clinical Trial Related Information， https://clinicaltrials.gov/ct2/home

上述網站是和大家分享的新冠病毒資源，這些數據全球的疫情防控能夠提供一些參考，給臨床的防治提供一些線索是至關重要的。

是否會有新的冠狀病毒侵入人群？

疫情當前，似乎提及未來可能新的冠狀病毒的出現有些早，但是新冠疫情帶來的巨大影響，提醒我們如何建立早期預警機制。病毒的跨種是一個很複雜的過程，前面我們提及冠狀病毒是從動物跨物種到人體上，進行病毒病原學研究的人員會加大動物源、臨床不明原因感染等疾病的病原組發現研究。臨床醫生是一線直接面對病人，接診病人的時候，面對一個發熱或者呼吸道感染的病人，做好個人面不防護做好自我保護，避免成為院內傳播源；針對無法明確病原的病例，選擇合適的實驗室檢測方法，快速鑑定可能的感染病原，臨床的需求也能推動檢測技術的完善和發展，更好地幫助臨床解決病原鑑定難題。

答疑討論

王一民：您剛才提到，一定要找到合適的標本去做明確的檢測，這樣得到的結果才更加可靠，這應該是未來應用到臨床中比較好的辦法。我們在臨床也在思考，到底什麼人該用什麼樣的方法去發現不同的病原體，這一直是很困擾臨床的問題。比如血流感染，用血培養的方法很好，可能用核酸檢測未必比血培養更加敏感；現在有很多結核的分子檢測，普通的抗酸染色比結核的培養敏感。但對於病毒而言，到底用什麼標本、用哪種檢測，還是非常困擾的一件事情。要解決這個問題，您認為臨床和實驗室需要做哪些溝通？臨床可以提供不同類型的標本，實驗室可以有不同的檢測技術，怎麼完善臨床與實驗室之間的關係，去開展合作或者研究？

任麗麗：這是非常關鍵的一個問題，沒有好的樣本就相當於「巧婦難為無米之炊」，對於實驗室來講，有多好的辦法也做不出來。但是如何拿到好樣本，並不是一成不變的。對於呼吸道感染來說，檢測人員很喜歡去問有沒有深部的樣本，比如如果是肺炎，我們就想要找到深部的樣本。但是新冠肺炎的事情告訴我們，並不是所有的醫療操作都很友好，那我們就不找侵襲性的樣本，但至少要拿到深部的痰樣本，沒有痰的話可以誘導痰。採拭子也可以，王辰院士一直強調採集鼻咽部拭子，因為鼻咽部的血流非常豐富，我們曾經做過比較，鼻咽部檢出率比較高。所以，當你懷疑是呼吸道病毒感染的樣本時，即使它可以引起其他類型的疾病，比如手足口病可以是呼吸道病毒感染的，但它引起手足口症狀，在早期去找到呼吸道樣本也能夠檢測出來。

所以，不論在科研還是與臨床醫生相互幫忙做相關工作的時候，我們首先強調的一點就是一定要找症狀部位的樣本，非常關鍵。因為我們曾經收到一份血樣本，請我們查一下是不是有流感病毒感染，普通的流感是很少能看到病毒血症的階段。做呼吸道病毒檢測的話，呼吸道樣本很關鍵，如果找不到深部的樣本，那採集鼻咽拭子，採樣的手法要經過專業的訓練。同時，我們建議採集呼吸道樣本的時候，儘量去採集一份血液樣本，目的不是為了檢測病毒的核酸成分，為了後面可以取病人的雙份血去看抗體增高的情況，這也是最經典的血清學方法。有人會覺得這個方法不是很聰明，不能夠早期快速診斷，這就是方法學的問題，前面給了核酸檢測的結果，你可能知道是流感病毒感染或者是副流感病毒感染，但到底是不是這樣的結果，血清學方法可以用來佐證。這就不能說太急於求成了，因為呼吸道病毒臨床檢驗方面待完善的地方比較多，實驗室的結果真正反饋到臨床上，大家之間的思維方式和考慮問題的角度還需要磨合。

王一民：是的，技術上有很多手段，臨床有需求又很急迫。臨床上往往是特別危重的病人才需要送到特殊的機構去進行檢測，這樣的情況又著急得到結果。所以也不能說是鴻溝，但是至少目前在溝通上還不能達到完全匹配的狀態，可能需要更多的解決辦法。作為臨床醫生來講，至少要堅持一點，既然要去送檢，就要選擇更優質的標本。剛才提到的更深部的標本、BALF標本，甚至是肺組織的標本，拿到檢驗機構檢測，這樣得到真實準確的結果的可能性也很大。

任麗麗：因為現在有很多可以選擇的方法，並不像10年前只能做PCR檢測等方法。時代不一樣了，有很多第三方機構做得很好，比如深度測序等，都可以完全利用起來。當然，檢測結果是需要臨床醫生根據病人的感染特徵綜合判斷，並不是說檢測結果是A，感染病原就是A。

王一民：還有一個問題，原來認為二級醫院可能開展病原檢測的能力不足，但是這次新冠疫情因為檢測人員的數量和標本的數量很大，所以要求二級以上的醫療機構都要加強核酸檢測的能力，尤其是病毒檢測能力的提高。這種情況下，您有沒有什麼建議給這樣的機構作為規範、精準的要求，提供給二級醫院，是不是簡單的按照試劑盒的步驟去做就行。

任麗麗：絕對不是這樣的。因為從檢測角度使用的樣本提取的核酸，我們肉眼是看不見的，但是核酸也會有氣溶膠，這種核酸氣溶膠會汙染樣本。大家都會看標準操作程序（SOP），都會用試劑盒，按照A+B+C配置體系，放在PCR儀裡面，設定程序。但是要注意每次加個模板，用加樣槍吸入的時候，動作要輕柔，否則引起的氣溶膠可能會汙染下一個樣本。所以強調在目前沒有可用的封閉式設備的前提下，還要通過提取核酸加模板的方式去操作時，一定要做好分區，配液室和加入模板的時候採用物理分割，加取樣本的人一定要穩，不求快，核酸氣溶膠的汙染一旦形成，去除難度較大，對實驗結果影響非常大。

還有，定期在實驗室做一個陰性對照，每一批都要做陰性對照，現在遇到的陽性病例不是很多，形成氣溶膠機率小。但假設會有下一輪疫情來襲，不一定是新冠病毒，也可能是其他病毒，大規模操作陽性的樣本，或者操作含有高濃度病毒樣本，可能引起的潛在汙染的風險還是很大的。所以一定要看好房間的定期的檢測汙染，一旦發現這個房間有問題，馬上要更換房間，所以我們要求為核酸檢測提供物理分隔。基層醫院可能沒有這麼多的設備去配備，比如通風負壓的房間，但是相對房間會比較重組，多備幾個加模板的房間，分期使用，有助於控制核酸氣溶膠的汙染。

總結一下，這是我自己的經驗教訓，我做了將近有十幾年的PCR檢測，應該有上百萬個了，指導了很多人。我們會呼籲大家一定要注意這幾點，第一，房間的物理分割。第二，建議大家配三套加樣槍，現在經費都不是大問題，因為在做PCR的時候，尤其是RT-PCR的長度只有80~120個bp（鹼基長度），它是用酶去消化，很難降解，只能通過自然沉降。一般情況下，加樣槍用了半個月之後就放在一邊，讓它自然沉降，換一把新的加樣槍，每半個月換一把加樣槍，注意在大量加樣的時候可能會遇到排槍，如果使用自動設備沒有關係，但是使用排槍加的話，第1道和第8道這兩個會容易有邊緣效應，容易出現異常的汙染情況，所以要求檢測人員格外關注做實驗的時候第1道和第8道有沒有假陽性。第三，操作人員要健康，如果有，發燒、身體不適、腹瀉和呼吸道症狀，不論輕重，不要進入檢測區域，可能攜帶的呼吸道病原，並不能被佩戴的外科口罩有效阻隔，可能會導致檢測體系汙染。

王一民：您說的這幾點很重要。特別是在這段時間面臨大量的臨床檢測樣本湧入實驗室，大家的精神壓力、身體壓力都很大，而且各級領導給我們的壓力也非常大。所以當面對這樣的挑戰的時候，如果大家做過一點基礎研究的話，可能都接觸過PCR技術，一定要沉下心來，踏踏實實的去做，從加樣的步驟到後面所有可能會遇到汙染的環節都在腦海中想清楚，這對解決臨床的問題和拿到真實的結果至關重要。

剛才您也提到，現在有自動化的儀器，比如小型的、快速的核酸檢測試劑盒，目前有沒有國內應用的或者比較成熟的試劑盒嗎？還是在努力的研發過程中？

任麗麗：對於新冠病毒來說，一些國內的科學家們正在努力研發，已經有一些雛形出來了，也得到了科技部的支持，也期待這些設備能夠儘快研發出來。我對這次的新冠疫情的感觸很深，很多年輕一代的優秀科學家原來是做比較高端的方法學，這次也都能夠沉下心來，在這半年安安心心的去做一件事情，怎麼樣能夠不需要提取核酸就能夠快速的在社區或者在家裡把核酸檢測做完，所以這是理念上的變化，肯定會推動著更多的、更好的檢測方法出來，這方面我們還是很樂觀的。

王一民：還想請您再幫我們深入評價一下抗體檢測和抗原檢測。在流感中使用抗原檢測比較多一些，但是對於新冠肺炎來說，好像一直沒有聽到太多關於抗原檢測的信息。抗體檢測聽到的比較多，但是質疑的聲音和討論的聲音也非常多。

任麗麗：新冠病毒的抗原檢測和抗體檢測是在檢測試劑研發和審批過程中大家都非常關注的一點。首先要明確一點，對於病毒感染來說，抗體檢測的方法學是沒有問題的。第二，為什麼大家會有這麼多質疑？還是因為對它的特異性、靈敏度存在一些看法，包括我們發表文章之後也受到質疑，認為我們的特異性有問題，後來我們給予了回答。現在我們獲得批准的一些抗體，已經很明確說明不能做群體流調，因為可能有很多因素存在，但是對於臨床醫生來講，怎麼去選擇？如果你高度懷疑一個病人是新冠病毒感染，但是怎麼做核酸檢測都是陰性的，千萬不要忘記血清學方法能夠忠實地反映病毒在體內感染的情況，所以不要排斥去做抗體檢測。但是抗體檢測並不是只做出新冠病毒總抗體陽性就好，還是要明確抗體類型是IgM還是IgG。

現在新冠肺炎雖然正在流行中，我們不能叫做後新冠時代，但是可以叫做即將面臨的後感染階段。第一輪感染已經結束了，臨床醫生如果手上有一個試劑盒是檢測新冠抗體的，在明年或者今年冬天，懷疑一個病人是新冠病毒感染，做出來的結果又是陽性的，沒有辦法判斷它是既往抗體殘留下來的，還是新感染的，所以一定要進行分型去測IgM。還要強調，這也是我們和各個企業曾經強調的定量的問題，滴度的變化會更好地幫助臨床醫生去回答這個感染有沒有進展的過程，因為這就是大家所說的無症狀感染或者長期持續排毒，如果監測血裡面的抗體，會幫助我們認識病毒到他的身體裡有沒有低水平的複製，但是有時候低水平複製的確不能刺激體液免疫，這也符合疾病多樣性特徵的。總指，不要排斥抗體檢測。我們強調的兩點，第一點是一定要分型，第二點是要研發定量的試劑盒。

關於抗原檢測，目前還沒有產品獲批使用。但抗原檢測對於確定早期感染是非常關鍵的方法，亟待發展。但是抗原檢測體系的特異性、靈敏度、檢測時間、窗口期等受到很多因素影響，也需要使用新鮮未滅活樣本，要考慮好應用的場景。國內有幾家研究機構和企業在努力推進抗原檢測試劑。其實用過流感的抗原檢測的臨床醫生都知道，大概50%的檢出率，但是即使是50%，也能極大的緩解臨床的壓力。所以，我儘快儘早推出抗原檢測方法。

王一民：對，實際上臨床醫生或者像我這樣的臨床醫生去看待一個感染相關的疾病，確實是這麼追求的。要追求病原診斷，找到敵人是誰，同時要了解敵人對人體的一些損害的表現，就是要檢測相應的一些免疫反應，無論是抗體，還是特異性的臨床特徵，還有拿到最精準的像病理的證據，如果拿不到病理，影像學在很大程度上是間接的病理證據。所以為什麼對高危人群要推行所謂1+3的政策，病人的核酸檢測+CT+抗體檢測＋血常規，這樣的檢測對於高危人群是非常可靠的臨床診療思路。最後能不能請您幫我們再總結一下對於新冠肺炎的看法，還有對未來包括核酸檢測的一些建議。

任麗麗：對於首當其衝的檢測方法來說，目前我國在多個層面上已經幫助去梳理了核酸檢測的流程，核酸檢測可以作為快速普篩，也是經濟的方法，在未來一段時間仍然會在檢測的領域中佔有主流。同時包括國內的科學家在努力推進，快速發展出來免提取、高靈敏、易判別、短時間時之內就給出檢測結果的方法，這是指日可待的，也是核酸檢測領域發展的一個方向。但是我們在發展這些檢測方法的同時，千萬不要忘了去追蹤新冠病毒的突變，因為我們不清楚曾經選擇的保守區域是不是在新冠病毒上也會一直保守下去。對於檢測方法而言，一定要綜合評估病人需要什麼樣的方法，如果從發病到來醫院看病是早期的情況，核酸檢測肯定首當其衝，如果做了幾次是陰性的話，不要排斥做血清學檢測。從沒有抗原檢測試劑可以使用的情況下，現有的可以分IgM、IgG抗體分型的方法還是可用的，幫助我們去輔助早期判斷病人的感染情況。

從研究的角度來講，目前還處於嬰兒期，需要不斷積累知識，面對新冠病毒我們仍然是一個初學者，我們要用很嚴肅的態度來對待它，不論是從科研、防控，還是臨床診療上。

王一民：再次感謝任教授。我在十期直播中也有一些感觸，大家通過新冠疫情又一次認識了醫生，也新認識了公共衛生領域的技術人員。我相信大家應該也認識到新冠抗疫過程中的科學家和技術人員，他們在幕後發揮了巨大的作用，從發現病原，發現早期突變的檢測，發現一些新型的成品化的試劑盒應用到臨床，發現未來的趨勢，去試圖解釋溯源的問題。所以，抗疫的英雄一定有這些偉大的科學家在幕後。我期待更多的對於新冠病毒的科學研究的誕生，也希望大家除了關注醫生、公衛人員之外，也一定要繼續支持和關注在幕後的那些科學家們。

本期直播嘉賓

任麗麗

博士。現任中國醫學科學院病原生物學研究所 克里斯多福·梅裡埃實驗室副主任、研究員、博士研究生導師，實驗室管理處處長。主要從事呼吸道病毒病原學研究。入選教育部2012年新世紀優秀人才培養計劃。現任國家衛生健康委病原微生物實驗室生物安全評審專家委員會委員，中華預防醫學會生物資源管理與利用分會第一屆委員會委員、中華預防醫學會感染性疾病防控分會第一屆委員會委員和中國研究型醫院空間微生物與感染專業委員會委員等，中華實驗和臨床病毒學雜誌通訊編委等。

主持人介紹

王一民

中日醫院呼吸與危重症醫學科主治醫師，中國醫師協會呼吸分會青年委員會委員，中國醫療保健國際交流促進會臨床微生物與感染分會青委副主委。

本文完

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本文由《呼吸界》編輯 大奔 整理、Jerry 排版，感謝任麗麗教授的審閱修改！