非培養的新型診斷技術迅速發展,如何順應感染性疾病病原學診斷的...

　　前言

　　感染性疾病仍是威脅人類健康的主要疾病，根據世界衛生組織（WHO）發布的數據，患感染性疾病死亡人數佔全球死亡總人數的28%，由於傳統病原學診斷滯後，難以滿足感染性疾病的診療需要，故WHO提出，臨床微生物實驗室應儘可能把目標集中於快速診斷方面，利用一切手段將實驗室數據轉化為臨床有用的信息。

　　近年來，基於非培養的新型診斷技術平臺正在迅速發展，給感染性疾病的診斷帶來了重大變革，包括檢測時間縮短、操作簡便及檢測準確度和精密度有所提升等，給臨床應用帶來了希望。

　　臨床微生物室一方面需不斷採用新的病原學診斷技術，提高臨床診斷效率；另一方面還需培養臨床醫生正確解讀報告的能力，提高診斷準確率，使病原學診斷新技術真正解決臨床診斷問題，進而提高抗菌藥物靶向治療的及時性，改善患者結局……

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　　病原學診斷新技術

　　1）即時檢驗

　　即時檢驗（POCT）指在患者初診時，短時間內便可提供診斷信息，使患者迅速得到治療，減少對經驗治療的依賴，從而促進抗生素的管理，減少感染傳播，控制感染性疾病的流行。

　　感染性疾病的POCT始於免疫層析法，目前最常用的是側流免疫層析法（LFIA）。

　　隨著分子診斷技術的發展，實時聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術可以滿足POCT速度快、成本低、易於操作的要求，成為POCT另一大主流方法。POCT還可提高經濟不發達地區感染性疾病的診斷能力。

　　以側流免疫層析法

　　為基礎的即時檢驗

　　以 LFIA為基礎的POCT的檢測原理：臨床樣本中微生物抗原與標記抗體結合，抗體-抗原複合物在固體基質通過毛細作用側向流動，在反應區產生可見的信號，而過量的標記抗體繼續遷移通過第二次抗體捕獲，導致出現第二條顏色帶，15 min內便可得到直觀結果。因其操作簡單、快速、無需或僅需簡單的儀器，操作人員無需培訓，非常適合現場檢測。

　　隨著免疫標記技術的發展，免疫標記物新型材料（如磁顆粒、螢光微球、量子點、上轉換螢光粉、碳納米顆粒、銪納米顆粒等）顯著提高了檢測靈敏度，可實現定量檢測；而試紙閱讀儀通過將檢測線和質控線的顏色強度轉變為光密度值，可實現定量分析。已有使用智慧型手機作為試紙閱讀器，利用內置軟體進行定量分析的報導。LFIA 在快速病原學檢測如肺炎鏈球菌尿抗原、軍團菌尿抗原、A群溶血鏈球菌、流感病毒抗原以及隱球菌莢膜多糖抗原檢測方面比較成熟。

　　以隱球菌多糖抗原為例，WHO在關於兒童、青少年和成人人類免疫缺陷病毒（HIV）感染者隱球菌病診斷、預防和管理快速推薦中指出，隱球菌病是HIV相關機會感染中最主要的感染之一，也是造成早期死亡的主要原因之一。診斷延遲導致腦膜炎發展至晚期，治療效果較差是這一現象的主要原因。

　　因此，WHO於2011年推薦採用 LFIA檢測隱球菌多糖抗原，對患者的腦脊液、血清或血漿進行篩查，針對陽性者給予預防性氟康唑治療，目的在於通過快速診斷、預防用藥，降低隱球菌的發病率和死亡率。

　　以實時聚合酶鏈式反應

　　為基礎的即時檢驗

　　LFIA對抗原檢測的性能依賴於臨床樣本中分析物的濃度。分析的濃度低於濃度檢測範圍可能產生假陰性結果。最近美國疾病預防控制中心在流感高發期，將流感病毒LFIA法與RT-PCR及病毒培養對比，提出對於流感病毒抗原檢測的陰性結果需謹慎解讀。

　　為了提高POCT在病原學快速診斷中的敏感度，將分子診斷應用於POCT，使感染性疾病的診斷有了革命性變化。

　　POCT分子診斷技術主要基於RT-PCR。RT-PCR技術是一種定量測定樣本中特定DNA序列的PCR。使用標記的PCR引物, 病原模板需95 ℃變性，低溫60 ℃左右復性，72 ℃延伸為一個PCR循環，需要經過30～40個循環擴增，在每個周期內放大，反應需要20～100 min，從而增加測試敏感度和特異度，但需要特定的設備，限制廣泛應用。

　　環介導等溫擴增技術（LAMP）是一種RT-PCR新的替代方法，LAMP法的特徵是針對靶基因上的6個區域設計4條引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恆溫60～65 ℃條件下進行擴增反應，可在15～60 min內實現109～1010倍的擴增，產生大量擴增產物即焦磷酸鎂白色沉澱，通過肉眼觀察有無白色沉澱以判斷是否存在靶基因。該技術不需要熱循環器，比PCR便宜、節能、操作簡便，更適於在經濟不發達地區使用，當前主要應用於瘧疾和結核病的快速診斷。RT-PCR比免疫層析法更敏感，但對技術和培訓程度要求更高，這可能會限制在不發達地區的使用。目前，病原學分子診斷檢測主要涉及如艱難梭菌、結核分枝桿菌、肺炎支原體、性傳播性疾病病原體、常見呼吸道病毒及腸道病毒的檢測，肝炎病毒的定量檢測和寄生蟲檢測。

　　近年來快速高度自動化病原學分子診斷平臺（如GeneXpert和FilmArray等）發展迅速，這些平臺均是基於核酸擴增檢測原理。GeneXpert平臺是基於PCR方法的全自動一體化核酸檢測系統，將整合樣品製備、擴增及檢測3個步驟集中於一個獨立試劑盒中，並進一步自動化和模塊化；其可檢測結核分枝桿菌、利福平耐藥菌、甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌、艱難梭菌等項目。

　　而FilmArray平臺則採用巢式多重PCR以及熔解曲線測定方法進行病原體靶標快速檢測與分析；通過陣列將每一種靶標的擴增反應分隔到單孔完成，並且針對每一種靶標設有3個重複，檢測結果更準確；儀器與測試條均為全封閉系統，核酸提取純化、PCR擴增與產物檢測均在一臺儀器中完成，同一測試可檢測多種病原。該產品按疾病系統分為上呼吸道感染測試（19種病毒和3種細菌），胃腸道感染測試（13種細菌、5種病毒和4種寄生蟲）以及腦膜炎/腦炎測試（6種細菌、7種病毒和1種真菌），提供了一種全面、快速、流線型的替代方法，其檢出病原體的覆蓋範圍廣，準確度和特異度比傳統培養及PCR更高。病原學分子診斷將不斷被探索和應用於臨床。

　　目前POCT產品種類繁雜，檢測原理、操作方法、質量控制與校準方式及周期差異均極大，不同產品檢測結果不可比，也為臨床準確診斷與治療帶來了極大挑戰。針對POCT質量管理體系建設，世界各發達國家均給予了極大關注。

　　2）快速微生物鑑定系統質譜技術

　　1906年，英國物理學家Thomson研製出世界首臺質譜儀，當時作為一種化學分析手段。20世紀80年代，軟電離技術的發明使檢測相對分子質量高達幾十萬的生物大分子成為可能，從而開拓了質譜學的嶄新領域——生物質譜。生物質譜迅速成為微生物鑑定領域的新寵，基質輔助雷射解吸電離質譜（MALDI-TOF-MS）技術即是其中之一。

　　原理

　　樣品同基質溶液混合後形成樣品結晶，結晶體被裝載至質譜儀後利用雷射轟擊結晶體，基質從雷射中吸收能量使得樣品解吸電離導致離子化分子在電場中飛行，不同質荷比的離子因到達檢測器的時間不同而被分開。通過構建的細菌鑑定質譜圖與資料庫圖譜比對，從而可將各種細菌進行鑑定區分。

　　優點

　　MALDI-TOF-MS技術與傳統方法相比，具有操作簡單快速、重複性強、靈敏度高、準確度好、自動化和高通量等特點，臨床主要應用於細菌、真菌的快速鑑定與分類。一種病原微生物的質譜鑑定試驗，包括樣品採集和製備，整個過程不到10 min，在感染性疾病的病原學快速診斷方面發揮了重要作用。

　　局限性

　　MALDI-TOF-MS技術雖然在微生物的鑑定上具有快速、簡單、成本低等優點，但該方法也存在一定的局限性。其準確鑑定依賴於完善的資料庫，如資料庫無待測菌譜圖，將無法得到鑑定結果；另一方面，MALDI-TOF-MS技術應於微生物鑑定是檢測細胞內核糖體蛋白圖譜，當核糖體蛋白圖譜相同時則無法鑑別；此外，有些微生物細胞壁的結構不同，需要個體化提取核糖體蛋白，蛋白提取成功與否，也決定能否準確進行鑑定。MALDI-TOF-MS技術鑑定微生物必須是可培養微生物，直接標本鑑定應用於臨床尚有待於進一步深入開發研究。

　　3）下一代測序技術

　　隨著人類基因組計劃在2003年徹底完成，基因測序技術不斷發展，下一代測序（NGS）技術逐步成為主流測序技術。NGS又稱高通量測序，包括二代大規模平行測序和三代大分子測序。

　　二代測序原理

　　將基因組DNA隨機切割成小片段DNA，在通過構建文庫、PCR擴增等技術流程獲得測序模板進行測序及數據分析，相對於Sanger測序通量高、速度快、費用低，但普遍存在讀長較短的缺點。

　　三代測序原理

　　不需要進行PCR擴增，通過不同手段區分鹼基信號差異，直接讀取序列信息，其讀長長、通量高，可以對RNA和甲基化DNA序列進行直接測序，但目前還存在錯誤率高、成本較高和生物信息分析軟體不夠豐富等缺點。

　　應用現狀

　　近年來，隨著全球感染性疾病譜的變化，疑難感染不斷增多，並非所有病原體均能在診斷實驗室中成功培養出來，而病原學分子診斷提供信息有限，NGS技術不依賴培養技術，直接檢測臨床樣本（血液、腦脊液、肺泡灌洗液等），應用NGS技術和生物信息分析軟體可快速全面鑑定細菌、病毒、真菌、寄生蟲，為疑難危重感染提供快速精準診斷依據，指導抗菌藥物的合理應用成為優勢。NGS在時間上與細菌培養所需時間相當，能檢測到不被培養的細菌並進行菌種鑑定，確定細菌種類的分類基因組學並可提供關於此細菌致病潛力的直接信息，通常對於作出準確的臨床決策至關重要。隨著成本降低，高通量測序有望在臨床廣泛應用。

　　存在問題

　　目前，NGS技術常規應用於臨床病原學檢測仍存在很多實際問題：（1）病原體鑑定的準確度很大程度取決於分析的參考資料庫的範圍和完整性；（2）臨床標本的複雜性，可能使病原體信息太少而導致數據丟失或病原體數據混雜在正常菌群中難以區分；（3）NGS測序數據的解讀至關重要，測序的長度、數量、質量以及試劑可能的細菌汙染，均可影響病原體識別，導致標本中細菌多樣性估計過高；（4）目前尚未建立不同標本測序前處理和參數設置的統一規定，微生物NGS測序質量評估、質量控制體系亦尚在建立中，美國食品藥品監督管理局尚未批准臨床微生物NGS測試。

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　　病原學診斷新技術臨床應用策略

　　1）基於循證檢驗醫學全面了解病原學診斷新技術的檢驗效能

　　目前各種新型診斷技術平臺層出不窮，基於上述技術的平臺診斷產品正不斷被探索和應用於臨床，臨床診斷正向著更快捷、準確、經濟的方向發展，因此各種新型診斷技術平臺的臨床應用問題顯得尤為重要。

　　現實是，製造商熱情提供試劑，臨床醫生和檢驗人員欣然接受，許多新的檢驗項目在檢驗效能未被充分了解之前，即已被積極推向臨床，其應用效果通常是在信息不完整的情況下由臨床醫生各自得出的。

　　例如，半乳糖甘露聚糖（GM）試驗在2008年版《麴黴菌病診治指南》中被建議用於高風險患者的篩查， 而2016年版《麴黴菌病診治指南》指出，對於血液系統惡性腫瘤及造血幹細胞移植患者，建議將血清和肺泡灌洗液中的GM作為侵襲性麴黴病的精確診斷標誌物，屬於高級別證據推薦意見。同時，必須認識到此推薦意見的適用人群具有一定範圍，且精確診斷標誌物和確診標誌物並不等同，不應過分強調GM試驗的價值。

　　過去幾年中，GM試驗實際被廣泛應用於非血液系統惡性腫瘤及造血幹細胞移植患者，造成檢測結果與診斷預期不符，試驗結果受到質疑。經過循證醫學研究確定了GM試驗的應用範圍，體現了感染性疾病診療的精細化。

　　循證檢驗醫學是依據循證醫學「以當前最佳證據為基礎」的原則，規範檢驗醫學的研究、設計和文獻評價，目的是向臨床提供有效檢驗證據、最有利於醫患雙方診斷試驗的診斷效能、成本-效果分析等信息。

　　Neal等提出了評估任何診斷性試驗效能的主要步驟

　　（1）該試驗能否可靠進行？確定該試驗的準確度、精密度和依賴於使用者的程度。

　　（2）是否在合適的人群中對該試驗進行了評估?試驗數據是從哪一部分人中得出的？

　　（3）是否使用了合適的參考標準？

　　（4）是否選擇了合適的臨界值來優化敏感度和特異度？理想的試驗能夠使敏感度和特異度最大化，從而使假陽性率和假陰性率最小化。

　　（5）陽性和陰性似然比是多少？陽性似然比越高越好，陰性似然比越低越好。

　　（6）該試驗在特定人群中的檢驗效能、陽性預測值和陰性預測值分別是多少？

　　（7）疾病成本與試驗成本之間的平衡如何？

　　當新型診斷技術應用於臨床時，檢驗人員有責任和義務通過循證醫學手段獲得新診斷技術的檢驗效能，即靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、陽性和陰性似然比及該試驗適用的特定人群等，以幫助臨床醫生更合理地選擇試驗，正確解讀報告。此項工作也將隨著臨床研究的進展而逐步更新。

　　2）臨床醫生應重視臨床經驗、微生物學特點、流行病學和最佳診斷證據有機的結合

　　在現代醫學快速發展的今天，許多臨床醫生往往過於重視新技術的掌握，卻忽視了臨床基本功的價值。

　　臨床醫生日積月累的臨床經驗是非常寶貴的，感染性疾病的循證醫學在強調醫生臨床經驗的同時，也強調臨床醫生必須掌握尋找證據、評估證據、應用證據的技能。

　　在應用靈敏度和特異度均很高的診斷試驗技術時，還要注意其應用的特定人群，在高危人群中進行篩查可獲得較高的陽性預測值，最佳證據也要應用於合適的人群才能達到最佳效果。

　　例如，血清和肺泡灌洗液中的GM可作為血液系統惡性腫瘤及造血幹細胞移植患者中侵襲性麴黴病的精確診斷標誌物，而不建議作為實體器官移植受者或慢性肉芽腫病患者篩查項目（強力推薦，證據級別高）。

　　因此把臨床經驗、病原微生物的特點、流行病學與最佳診斷證據多方面信息有機結合，才能得到科學的臨床決策。

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　　結語

　　由於感染性疾病具有宿主易感性、感染部位及致病微生物複雜多變等諸多特性，臨床微生物實驗室已從過去強調技術的先進性和前沿性，轉變為從循證醫學角度關注技術如何為臨床提供最佳證據。

　　臨床醫生則需將感染性疾病的臨床表現、病原微生物特點、流行病學特點及最佳診斷證據等多方面信息有機結合，制定更加準確的治療方案，以實現感染性疾病的精準治療。

　　作者介紹

　　張堅磊

　　（本文第一作者）主任技師，天津市第一中心醫院檢驗科微生物室主任，天津市檢驗質量管理委員會委員。長期主持天津市臨床微生物室間質量評價工作，負責天津市細菌耐藥監測網，中國研究型醫院學會感染性疾病循證與轉化專業委員會委員 等。

　　馬小軍

　　（本文通訊作者）感染性疾病/醫院感染控制專業；北京協和醫院感染內科副主任，主任醫師/教授；侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室副主任；中國研究型醫院學會感染性疾病循證與轉化專業委員會主任委員；中國醫院協會醫院感染專業委員會副主任委員 等。