原創 中山醫院感染團隊 SIFIC感染官微 收錄於話題#感染性疾病的精準診治8個
快速、準確的病原學診斷，能儘早選擇敏感的抗感染藥物或採取有效、具有針對性的防控措施，是感染性疾病精準化防治的核心。宏基因二代測序作為一種新興的檢測技術，能夠不依賴微生物培養而檢出臨床樣本中的所有微生物，該技術已在國內被廣泛應用，並展現了其快速、無偏倚和高檢出的優勢。
《中國臨床醫學》雜誌第27卷第4期特設立「感染性疾病精準診治」專題報導，收錄了復旦大學附屬中山醫院「感染-感控-微生物」團隊多篇相關文章，以8篇文章的全篇幅，整體展現了其在疑難複雜感染的病原診斷、醫院感染防控中的意義。
SIFIC團隊特此專欄報導，昨天已為大家帶來兩篇精彩文章，今天繼續為大家帶來《宏基因二代測序技術對慢性肺麴黴病病原學診斷的價值》，看中山醫院感染團隊為我們解讀二代測序技術在慢性肺麴黴病診斷中的應用，希望您能從中獲益。
宏基因二代測序技術對慢性肺麴黴病病原學診斷的價值
作者：張堯，繆青，金文婷，史慶豐，蘇逸，馬玉燕，王青青，潘珏，胡必傑
單位：復旦大學附屬中山醫院感染病科
【摘要】
目的：探討宏基因二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技術對慢性肺麴黴病(chronic pulmonary aspergillosis，CPA)病原學診斷的價值。方法：回顧性收集2017年9月至2019年9月復旦大學附屬中山醫院感染病科收治的78例疑似CPA患者病例資料，採集樣本進行常規微生物學培養、血清煙麴黴特異性抗體IgG檢測和mNGS，比較3種檢測方法的靈敏度和特異度。根據診斷標準，將78例疑似CPA患者最終診斷結果分為CPA組(35例)和非CPA組(43例)。結果：以最終診斷結果為金標準，常規培養法、煙麴黴特異性抗體IgG檢測和mNGS的靈敏度分別為28.6%、48.6%和65.7%，特異度分別為93.0%、90.7%和86.0%，其中mNGS的靈敏度顯著高於常規培養法(P=0.001)。ROC曲線下面積分別為0.759、0.696和0.608。結論：在CPA的診斷中，mNGS的靈敏度顯著高於常規培養法和煙麴黴特異性抗體IgG檢測，且在檢測時間上具有明顯優勢。
【關鍵詞】宏基因二代測序技術；慢性肺麴黴病；診斷
麴黴菌在自然界中分布廣泛，人類往往通過吸入麴黴分生孢子引起感染。由於宿主免疫狀態不同，麴黴菌可引起各種臨床症候群，包括侵襲性肺麴黴病(invasive pulmonary aspergillosis，IPA)、慢性肺麴黴病(chronic pulmonary aspergillosis，CPA)和過敏性疾病等。近年來，由於器官移植患者的增加、愛滋病患病率的快速增長和廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑、糖皮質激素和抗腫瘤藥物的大量使用，肺麴黴病的發病率和死亡率有增高趨勢。因此，早期識別和診斷此類疾病對改善預後具有重要意義。常規的CPA診斷主要通過從肺組織活檢樣本中檢出麴黴孢子或菌絲作為確診依據，或根據痰液、BALF等呼吸道樣本的真菌培養結果進行診斷，但組織活檢和真菌培養對檢出肺麴黴病能力有限，且耗時較長。
宏基因二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技術作為一種新型的基因檢測技術，理論上可快速、無偏倚地檢測樣本中所有病原體，包括細菌、病毒、真菌、寄生蟲等，特別適用於罕見的、新現的和非典型的病原體。研究表明，mNGS在病原體的早期診斷方面具有較高的敏感性，並且不受抗感染藥物的影響，是感染性疾病可靠的檢測手段。本研究回顧性分析2017年9月至2019年9月復旦大學附屬中山醫院感染病科收治的78例疑似慢性肺麴黴病患者，採集樣本進行mNGS、煙麴黴特異性抗體IgG檢測和常規微生物培養，根據最終確診結果評估mNGS在CPA診斷中的價值。
1、資料與方法
1.1研究對象 回顧性分析2017年9月至2019年9月復旦大學附屬中山醫院感染病科住院的78例疑似慢性肺麴黴病患者，同步採集樣本進行常規微生物培養、血清煙麴黴特異性抗體IgG檢測和mNGS，根據診斷標準確診後分為CPA組(35例)和非CPA組(43例)。本研究經復旦大學附屬中山醫院倫理委員會審核批准(No.B2017-193R)，所有患者均知情並籤署知情同意書。
1.2CPA的診斷標準 CPA的診斷包括確診和臨床診斷，確診標準根據歐洲臨床微生物與感染性疾病學會和歐洲呼吸學會發布的慢性肺麴黴病的診斷和管理指南以及美國感染病學會定義的診斷標準，同時滿足以下條件。
慢性肺部症狀、慢性肺病或進展性影像學異常，如空洞、空洞周圍浸潤及真菌球；
沒有或輕度的免疫功能損害，通常有一個或多個基礎肺疾病；
麴黴IgG抗體升高或其他微生物學證據(如痰液、BALF或肺組織麴黴培養陽性、血清GＭ試驗陽性、組織病理學見黴菌樣菌絲)。
臨床診斷指滿足診斷標準中的第1條和第2條，但無麴黴感染的血清學、微生物學或病理學證據，臨床醫生在排除其他疾病後做出診斷，並且抗麴黴治療後患者症狀有好轉。
1.3常規微生物培養法 將收集到的痰樣本按照微生物接種方法接種於沙保羅瓊脂培養基，將BALF樣本接種於沙保氏葡萄糖瓊脂培養基，置於25℃和35℃恆溫培養箱中培養2～7d，每天對菌落的形態和生長情況進行肉眼觀察。
1.4血清煙麴黴特異性抗體IgG檢測 採用酶聯免疫法測定煙麴黴特異性抗體IgG，將稀釋後的患者血清樣本加到包被麴黴半乳甘露聚糖的酶標板中，血清中的麴黴IgG便與抗原結合，再加入抗人IgG酶標抗體和四甲基聯苯胺產生顯色反應，用酶標儀在450nm波長下測定其吸光度，通過標準曲線計算樣本中的麴黴IgG抗體濃度。煙麴黴特異性抗體IgG≥120AU/mL，定義為陽性。
1.5mNGS檢測
1.5.1樣本處理和DNA提取 取0.6mL呼吸道樣本(痰液、BALF、肺組織勻漿)，經玻璃珠混合震蕩後使用TIANamp Ｍicro DNA Kit(DP316，天根生化科技有限公司，中國)試劑盒提取DNA。提取的DNA用作DNA文庫構建。
1.5.2文庫構建和測序 採用Agilent 2100 Bioanalyzer質控文庫插入片段大小，採用Qubitds DNA HS Assay Kit(Thermo Fisher，美國)質控DNA文庫濃度，經環化形成單鏈環形結構。環化後的文庫經滾環複製(RCA)生成DNB納米球。製備好的DNB納米球加載到測序晶片，採用BGISEQ-500進行測序。
1.5.3數據分析 測序數據下機後去除低質量的和長度小於35bp的數據以獲得高質量的數據。通過BＷA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對，將高質量數據中比對上人參考基因組序列的數據去除，剩下的數據去除低複雜度reads後與專用的微生物大資料庫比對，並將比對後的數據按照病毒、細菌、真菌和寄生蟲等進行分類和排列。
1.5.4mNGS麴黴陽性定義 以屬嚴格序列數(SＭRNG)或種嚴格序列數(SＭRN)≥2為陽性界定值。
1.5.5統計學處理 採用SPSS22.0進行數據分析。計量資料中的正態數據以x±s表示，非正態數據以Ｍ(P25，P75)表示。採用PearsonX2檢驗、Fisher確切概率法或ＭcNemer檢驗。檢驗水準(a)為0.05。
2、結果
2.1一般資料 結果(表1)顯示：2組患者年齡、性別和mNGS樣本類型差異無統計學意義。送檢的78例樣本中，痰樣本55例、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)樣本17例、肺組織樣本6例。35例CPA患者中，28例有基礎疾病，其中，有肺結核史9例、有COPD和支氣管擴張症9例、有近期糖皮質激素治療史6例、有實體器官腫瘤4例、有非結核分枝桿菌感染史2例。
表1 78例疑似CPA患者一般資料
2.2分析靈敏度和特異度比較 結果(表2)顯示：以最終臨床診斷(包括確診和臨床診斷)為金標準，mNGS的靈敏度和特異度分別為65.7%和86.0%，靈敏度高於煙麴黴特異性抗體IgG檢測和常規微生物培養法，並且與常規培養法之間的差異有統計學意義(P=0.001)。
表2 不同檢測方法診斷CPA的靈敏度和特異度
在CPA組中，僅通過臨床診斷確診的CPA患者有8例，其中4例(50.0%)患者mNGS結果陽性。培養陰性的CPA患者有25例，其中有14例(56.0%)患者mNGS陽性，12例患者煙麴黴特異性抗體IgG陽性。
2.3診斷價值比較 結果(圖1)顯示：mNGS、煙麴黴特異性抗體IgG檢測和常規微生物培養法的ROC曲線下面積(area under curve，AUC)分別為0.759、0.696和0.608，提示mNGS對診斷CPA的診斷價值更高。
圖1 3種檢測方法的ROC曲線
2.4不同樣本類型中mNGS結果比較 35例CPA患者樣本中，痰樣本、BALF樣本和肺組織樣本的mNGS陽性率分別為56.5%(13/23)、77.8%(7/9)和100%(3/3)，BALF的mNGS陽性率最高，但3種樣本間差異無統計學意義(P=0.341)。
3、討論
CPA在全球範圍廣泛分布，其發病率逐年上升。目前診斷CPA主要根據臨床表現、影像學特徵和提示麴黴感染的實驗室結果綜合判斷，診斷非常困難。本研究結果提示，對於診斷CPA，mNGS、煙麴黴特異性抗體IgG檢測和常規培養的靈敏度分別為65.7%、48.6%和28.6%，mNGS的靈敏度最高，mNGS法優於常規培養法。Ｍiao等關於mNGS的回顧性研究表明，mNGS對診斷感染性疾病的靈敏度和特異度分別為50.7%和85.7%，特別是在結核分枝桿菌複合群、病毒、真菌和厭氧菌病原體中，mNGS的陽性率明顯高於常規培養，並且檢測結果不受早期抗菌藥物暴露的影響。Li等對mNGS檢測肺組織感染性病原體的回顧性研究發現，與常規培養相比，mNGS具有檢測時間短、靈敏度高的特點，可無偏倚地檢測出苛養菌及厭氧病原體，其檢測細菌的靈敏度和特異度分別為100%和76.5%，檢測真菌的靈敏度和特異度分別為57.1%和67.5%。與本研究結果一致。mNGS檢測方法的AUC高於煙麴黴特異性抗體IgG和常規培養，進一步說明mNGS對CPA診斷價值最高。
Ｍiao等的研究發現，在非結核分枝桿菌感染患者中，BALF樣本中mNGS檢測的陽性率高於痰樣本，但在結核分枝桿菌、麴黴和隱球菌感染的患者中，痰樣本、BALF樣本和組織樣本間的mNGS陽性率差異無統計學意義。本研究中，痰樣本、BALF樣本和肺組織樣本的mNGS陽性率分別為56.5%、77.8%和100%，但三者間的差異無統計學意義，與既往研究結果一致。
煙麴黴特異性抗體IgG檢測是機體對麴黴菌感染後出現的特異性免疫反應，檢測患者血清中特異性IgG抗體可確定患者機體免疫狀態，從而對肺麴黴病的臨床診斷具有重要意義。IDSA指南也將煙麴黴特異性抗體IgG列為CPA的診斷標準之一。研究表明，煙麴黴特異性抗體IgG檢測診斷CPA的靈敏度可達75%～98%。但在本研究中，煙麴黴特異性抗體IgG的靈敏度僅為48.6%，可能與不同的研究中判斷閾值不同及檢測方法有關。而mNGS的靈敏度明顯高於煙麴黴特異性抗體IgG檢測法，二者之間的差異無統計學意義，可能與樣本量較少有關。
真菌培養是診斷CPA的基本檢測方法，根據不同的研究報導，CPA患者的呼吸道樣本真菌培養陽性率為11.8%～81.0%，同時由於麴黴可在氣道定植，因此可造成一定的假陽性。本研究中，呼吸道樣本培養診斷CPA的靈敏度僅為28.6%，顯著低於mNGS。常規微生物培養和鑑定依賴於活的微生物的生長倍增速度，對於常見的細菌性病原體往往至少需要48h，對於真菌至少需要7d。而mNGS可在採集樣本後24～36h內出具檢測結果，大大縮短了檢測時間，為感染性疾病特別是重症和疑難感染的診斷和治療爭取了時間。
本研究存在一些不足之處：(1)本研究為回顧性研究且納入的病例數較少，因此關於mNGS在CPA中的診斷價值需要更大樣本研究進一步證實；(2)由於GＭ試驗對診斷CPA的靈敏度和特異度都較低，本研究中的CPA患者GＭ陽性率僅為14.3%，且GＭ試驗多用於侵襲性肺麴黴病的診斷，故未分析GＭ試驗的靈敏度和特異度。
綜上所述，在CPA的診斷中，mNGS的靈敏度顯著高於常規培養法和煙麴黴特異性抗體IgG檢測法，且在檢測時間上優勢明顯。
參考文獻：略（見原文）
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原標題：《專題報導丨宏基因二代測序技術對慢性肺麴黴病病原學診斷的價值》
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