【安捷倫】鑑定新型冠狀病毒,宏基因組二代測序(mNGS)技術十分關鍵!

自 2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV）肺炎疫情爆發以來，相關科研單位便緊鑼密鼓地開展病毒研究工作，並取得了一系列重要的研究成果。2 月 3 日，Nature 在線發布了復旦大學張永振教授團隊的一項重要研究成果，該團隊對患者支氣管肺泡灌洗液進行了宏基因組二代測序（mNGS），鑑定出了一種新型冠狀病毒，並發現該病毒基因組與蝙蝠體內發現的 SARS 樣冠狀病毒基因組有 89.1% 的相似性^[1]。

張永振教授團隊發表的文章截圖 | 圖源：Nature

2 月 20 日，bioRxiv  預印本平臺發布了華南農業大學沈永義教授、肖立華教授團隊關於新冠病毒中間宿主的研究成果。通過對穿山甲樣品進行宏基因組分析，該團隊發現穿山甲為新型冠狀病毒潛在中間宿主^[2]。

沈永義教授、肖立華教授團隊發表的文章截圖 | 圖源：bioRxiv

可以說，宏基因組測序在新病原體的診斷、監測、跟蹤，以及溯源方面具有關鍵作用，更是新冠病毒研究的一大助力。

宏基因組測序：病原體檢測的新風口

1998 年，威斯康辛大學的 Jo Handelsman 提出宏基因組學（Metagenomics）的概念，並將其定義為：一種以環境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關係、功能活性、相互協作關係、以及與環境之間的關係為研究目的的新的微生物研究方法^[3]。

包括宏基因組學在內的各類組學研究（右）相較傳統遺傳學與生物化學方法（左）在全基因水平的研究上效率更高 | 圖源：Science

2014 年，新英格蘭醫學雜誌發表宏基因組二代測序（mNGS）確診鉤體病的首例臨床應用案例^[4]，打響了病原體 mNGS 的第一槍。

新英格蘭醫學雜誌發表宏基因組二代測序（mNGS）確診鉤體病的文章截圖 | 圖源：NEJM

短短 5 年來，mNGS 在新發病原體鑑定、罕見重要病原體診斷和臨床大數據研究等方面取得諸多進展。例如在 2018 年，Clinical and Research in Hepatology and Gastroenterology 發布了上海華山醫院感染科張文宏教授團隊使用 mNGS 協助臨床診斷肝結核的案例，mNGS 的適時使用，準確快速地幫助臨床明確了患者的發熱病因，推動了臨床的精準診斷^[5]。

張文宏教授團隊發表文章截圖 | 圖源：ScienceDirect

2019 年，中國臨床專家也達成共識，認可了宏基因組分析和診斷技術在急危重症感染領域的臨床應用^[6]。

臨床專家共識文章截圖 | 圖源：萬方

宏基因組二代測序的流程及原理

宏基因組二代測序的檢測流程可以大致分為5個步驟：核酸提取、文庫構建、上機測序、生物信息學分析與報告解讀[7]。

具體來看，對於不同的臨床樣本，核酸提取前需要進行不同的前處理，比如痰液液化、破壁、去宿主等以提高病原體檢出率。RNA 病毒需要在文庫構建前進行逆轉錄，生成 cDNA。文庫構建的目的在於給未知序列的核酸片段兩端加上已知序列信息的接頭以便於測序，單樣本文庫構建完成後需要經歷 PCR 擴增、再將多個文庫樣本混合後進行測序。

測序完成後，數據會自動進入搭建好的病原體自動分析流程，該流程包括去除人源宿主序列和低質量序列、以及微生物資料庫比對注釋等步驟。最後，解讀專家根據自動化系統產生的初步結果，再結合部分臨床指標、樣本類型、病原體種類等因素進行綜合分析解讀。

宏基因組工作流程示意圖 | 圖源：Nature Biotechnology

樣本文庫質量是宏基因組測序的關鍵

由於環境中的微生物種類五花八門，相對複雜，構建一個高質量的宏基因組文庫在整個檢測流程中便顯得十分重要。故而在取樣時，我們要嚴格遵循取樣規則，在取樣中應儘量避免對樣本的幹擾，縮短保存和運輸的時間，使樣品儘可能代表自然狀態下的微生物原貌。並且要採用合適的方法，既要儘可能地完全抽提出環境樣品中的 DNA/RNA，又要保持較大的片段以獲得完整的目的基因或基因簇。

在構建 RNA 文庫之前需要對 RNA 樣本進行完整性評估^[8]，只有達標的樣本才能進入下一階段反轉錄及文庫構建。宏基因組文庫的質量直接關係到測序的數據量，在影響成本的同時也影響了測序時間，因此，為了提高測序準確性、減少測序過程中的風險，測序前需要測定文庫樣品的濃度和片段大小分布，確定合適的上機 pooling 方案和測序深度。可見樣本的質量控制對於宏基因組測序的重要性。

安捷倫自動化樣本質控解決方案

安捷倫在核酸蛋白質量控制領域擁有愈二十年的經驗，針對不同來源樣本，分析靶標和通量需求提供全套的自動化解決方案。安捷倫的 2100 生物分析儀是目前最為普遍使用的二代測序質控設備。安捷倫在 2100 生物分析儀上最早開發出了 RNA 完整性參數（RIN），它已成為全世界公認的 RNA 質控指標，它以 0-10 的數值直觀反應 RNA 樣本的完整性程度，為標準化的實驗操作提供了樣本質量評估的參考標準。在本次新冠病毒（RNA 病毒）的序列確定中，安捷倫 2100 生物分析儀發揮了重要作用。

隨著測序樣本量的增加，特別是隨著後續病毒變異監測以及病毒溯源工作的逐步展開，安捷倫中-高-超高通量自動化核酸質控平臺（4200 tapestation 和 AATI FA）將發揮它們的優勢。

參考文獻

[1] Yong-Zhen Zhang , Edward C. Holmes,Lin Xu,et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China[J].nature,2020.

[2] Xiao K, Zhai J, Feng Y, et al. Isolation and Characterization of 2019-nCoV-like Coronavirus from Malayan Pangolins[J]. bioRxiv, 2020.

[3] Handelsman J, Rondon M R, Brady S F, et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products[J]. Chemistry & biology, 1998, 5(10): R245-R249.

[4] Wilson M R, Naccache S N, Samayoa E, et al. Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing[J]. New England Journal of Medicine, 2014, 370(25): 2408-2417.

[5] Jing-Wen A , Yang L , Qi C , et al. Diagnosis of local hepatic tuberculosis through next-generation sequencing: Smarter, faster and better[J]. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology, 2018, 42(3):178-181.

[6] 宏基因組分析和診斷技術在急危重症感染應用專家共識組. 宏基因組分析和診斷技術在急危重症感染應用的專家共識[J]. 中華急診醫學雜誌, 2019, 28(2):151-155.

[7] Quince C, Walker A W, Simpson J T, et al. Shotgun metagenomics, from sampling to analysis[J]. Nature biotechnology, 2017, 35(9): 833.

[8] Fan W, Su Z, Bin Yu, et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China[J]. Nature. 2020 Feb 3. [Epub ahead of print]

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