科普‖帶你了解第一代基因測序技術

基因(遺傳因子)是具有遺傳效應的DNA片段(部分病毒如菸草花葉病毒、HIV的遺傳物質是RNA)。基因支持著生命的基本構造和性能。儲存著生命的種族、血型、孕育、生長、凋亡等過程的全部信息。環境和遺傳的互相依賴，演繹著生命的繁衍、細胞分裂和蛋白質合成等重要生理過程。生物體的生、長、衰、病、老、死等一切生命現象都與基因有關。它也是決定生命健康的內在因素。

第一代基因測序技術的發明人

基因測序是一種新型基因檢測技術，能夠從血液或唾液中分析測定基因全序列，預測罹患多種疾病的可能性，個體的行為特徵及行為合理。基因測序技術能鎖定個人病變基因，提前預防和治療。

該技術始於20世紀70年代中期，1977年Maxam Gilbert報導了通過化學降解測定基因序列的方法。同一時期，英國劍橋分子生物學實驗室的生物化學家Fred Sanger及其同事在1975年發明了雙脫氧鏈終止法。傳統的鏈終止法，化學降解法，以及在它基礎上來的各種DNA測序技術統稱為第一代DNA測序技術。

第一代基因測序技術的原理

化學裂解法，其基本原理是特定化學試劑可對鹼基進行特異性修飾，在修飾鹼基處(5』或3』)打斷磷酸二酯鍵將一個DNA片段的5』端磷酸基做放射性標記，再分別採用不同的化學方法修飾和裂解特定鹼基，從而產生一系列長度不一而5』端被標記的DNA片段，這些以特定鹼基結尾的片段通過凝膠電泳分離，再經放射自顯影，確定各片段末端鹼基，從而得出目的DNA序列。該方法能夠檢測雙鏈DNA，但是其操作繁瑣，程序複雜，被同時期的Sanger雙脫氧鏈終止法取代[2]。

雙脫氧鏈末端終止法，其原理是將2』,3』-雙脫氧核苷酸(ddNTP)參入到新合成的DNA鏈中，由於參入的ddNTP缺乏3』-羥基，因此不能與下一位核苷酸反應形成磷酸二酯鍵，DNA合成反應將終止。測序時分成四個反應，每個反應中加入DNA聚合酶、待測模板、引物、四種脫氧核糖三磷酸(dNTPs)，除此之外還要加入一種雙脫氧核苷三磷酸(ddNTPs)，然後進行反應，ddNTPs隨機取代相應的dNTPs，由於其3位的羥基變成了氫，不能繼續延伸，使正在延伸的寡聚核苷酸選擇性的在A、T、C或G處終止。終止的核苷酸由相應的ddNTPs決定，通過電泳可分離出長度不同的片段，再對這些片段的末端鹼基進行檢測從而獲得所測片段的鹼基序列。

最初對凝膠片段末端鹼基的檢測是用同位素標記法，20世紀80年代，用螢光進行標記，可自動測序，到20世紀90年代，隨著毛細管電泳技術以及微陣列毛細管電泳技術的發展，測序的通量得到大幅度提高。

雙脫氧鏈末端終止法的優點有：

1)可用於未知或已知突變的檢測，更容易實行；

2)假條帶的出現減少，結果更加清楚；

3)讀取的長度也較長；

4)因為摻入了同位素標記的三磷酸，末端終止法可以測更小序列的核苷酸鏈；

5)基本適用於所有的突變類型，準確率幾乎100%，在單基因病的基因診斷和產前診斷中仍廣泛使用。

雙脫氧末端終止法的缺點：

1)離不開PCR擴增，且只能分析單個的DNA片段，通量小，不能進行基因組層面的分析；

2)自動化程度低，檢測速度慢，對於某些需要快速檢測的疾病不適合；

3)雙脫氧鏈末端終止法成本高，不適用於大規模測序。

第一代基因測序技術的應用

第一代測序技術既可以用於測定DNA序列，也可以用於測定DNA分子的片段長度。其中基於片段分析的微衛星(STR)分析是現代法庭DNA鑑定的核心技術。

人類基因組的測序正是基於第一代基因測序技術完成的。Sanger測序這種直接測序方法具有高度的準確性和簡單、快捷等特點。目前，依然對於一些臨床上小樣本遺傳疾病基因的鑑定具有很高的實用價值。例如，臨床上採用Sanger直接測序 FGFR 2 基因證實單基因Apert症候群和直接測序 TC0F1基因可以檢出多達90%的與TreacherCollins症候群相關的突變。

第一代測序技術一直作為基因診斷的標準，在基因病特別是單基因病症病人和各種遺傳性酶病如苯丙酮尿症、自毀容貌綜合症等其他疾病的診斷上發揮著舉足輕重的作用，是最常用的基因測序技術。