摘要：5月25日晚8點，由火石創造主辦的第十期火石百家邀請到了海普洛斯生物科技有限公司創始人許明炎許總，與群友們分享基因測序市場的機會。基因測序市場火熱，但是上遊測序儀及試劑基本已寡頭壟斷，國內創業公司在上遊技術及產品上到底還有沒有機會？在基因領域的創業者又該注意哪些？請聆聽來自的許總的精彩分享。
本次分享一共從以下6個方面進行分析：
1.種分子檢測技術
測序是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的鹼基處終止，並且在每個鹼基後面進行螢光標記，產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然後在尿素性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA鹼基序列。Sanger測序是針對已知致病基因的突變位點設計引物，進行PCR 擴增直接測序。單個突變點的擴增(包括該位點在內的外顯子部分片段的擴增)，不必將該點所在基因的全部外顯子都擴增。所以單基因或部分基因控制的疾病樣本檢測，Sanger測序可以發揮精準和成本低的優勢。通過將待測樣本的序列與已知標準樣本序列比較，尋找突變信息。
一代測序
一次只能檢測一個基因的某個片段中的已知位點，靈敏度較低，對待測樣本量的需求較大。
相對一代測序而言，二代測序可以同時檢測數十至數百個基因，並且可以探測到許多未知位點的信息，靈敏度高達99.99%並且需要的起始樣本量只需幾十納克。二代測序的核心思想是變合成邊測序，不同顏色的螢光標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的螢光，根據捕捉的螢光信號並經過特定的計算機軟體處理，從而獲得待測DNA的序列信息。通量高，相對於一代測序針對單個基因的檢測，大大降低了測序的成本。
微滴式數字PCR系統
在傳統的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應體系分成數萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。經PCR擴增後，對每個微滴的螢光信號進行逐一分析，有螢光信號的微滴判讀為1，沒有螢光信號的微滴判讀為0，根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度。其靈敏度高達0.001%，能克服核酸降解的不利影響，非常適合稀有樣本中核酸的精確檢測。
多種測序技術的對比，臨床金標準qPCR一次只能針對一個已知位點進行檢測，而一代測序可以同時檢測多個位點。晶片技術和二代測序的通量都非常高，可以同時檢測多個基因的多個位點，但是晶片技術的敏感度和準確性都遠不及二代測序。
用一個成語來比喻測序技術就是「守株待兔」，那麼不同的技術和平臺有各自的特點。qPCR就是守著已知的位點等著兔子撞上來，而一代測序同時守著數百樹樁，但是只能抓住已知的幾隻兔子。二代測序和晶片的工作量就大很多了，檢測的位點從百萬到上億，二代測序更是會產生突破性的創新，發現以前未知的突變信息。
這個圖表總結了各種檢測技術的靈敏度和準確率。如果需要檢測的對象是20%-50%的變異，例如臨床用的組織樣本，切片50%以上都是腫瘤細胞，那麼利用一代測序就可以完成這個工作。如果腫瘤細胞含量較少的組織，穿刺或者胸水，可以使用ARMS法或者二代測序法，可以檢測5%的腫瘤細胞。ctDNA的含量低於1%時，就需要用核心技術來降低測序錯誤和PCR擴增產生的錯誤，減少假陽性的發生。
2.NGS和液體活檢臨床應用
ctDNA的特點：
腫瘤進化追蹤
目前對於腫瘤的進化追蹤，相關研究還是挺多的，不同部位的癌細胞其變異程度是不一樣的，根據變異DNA的相似程度從而像進化樹樣可以描繪出疾病的發展變化。
腫瘤異質性評估
在腫瘤發展的不同階段會出現不同的細胞克隆，對其分別進行採樣分析會發現有不同的DNA出現。血液樣本中ctDNA含有的隨機突變反映了腫瘤單克隆群的不同大小和活性，並揭示出腫瘤異質性變化的順序。
3.HaploX的研究及其進展
截至目前HaploX已經收錄了20個經典資料庫，包含了50000種以上藥物反應的數據，並且可以將87%以上的癌症進行分類，HaploX可以100%地將小細胞肺癌和非小細胞肺癌進行分型。資料庫裡有3000多個患者的數據，1000多份報告以及4000裡樣本數據，這些數據量高達60T。
4.基因測序技術的發展趨勢
目前市面上主要的基因測序平臺，進口的測序儀佔領了90%以上的市場，其中以Illumina為主。
接下來簡單介紹一下一些測序技術：
三代測序分為單分子測序技術和納米孔技術。相對於二代測序，三代測序大大增加了測序的讀長，但是測序產生的錯誤率較高，目前仍是阻礙單分子測序發展的阻力。PacificBiosciences公司的SMRT技術也是基於邊合成邊測序的思想，與單分子測序儀不同的是，該方法以SMRT晶片為測序載體進行測序反應。另外值得注意的是，與其他方法不同，該方法中螢光標記的位置是磷酸基團而不鹼基，再根據螢光的種類就可以判定dNTP的種類。此方法使得螢光強度變大而易於檢測。SMRT技術實現了速度快的特性，對大量基因的測序有重大意義。
5.NGS臨床專家共識、如何產品化
今年3月在第十三屆中國肺癌高峰論壇上，吳一龍教授發布了液體活檢和二代測序步入學術共識：
共識一
精準醫學是一項系統工程，包括：
任何一項的缺失都不允許。
共識二
液體活檢是一項富有挑戰性的新技術，在精準醫學中扮演著越來越重要的角色。
液體活檢的檢測對象包括：循環腫瘤細胞、血漿 DNA、Exosome
液體活檢的檢測技術包括：ARMS（包括 superARMS）、ddPCR（包括 BEAMing）、NGS
共識三
共識四
用於發現未知基因，探索療效監測、預後判斷和發現耐藥機制等，液體活檢技術建議使用 NGS。
6.國內創業者的機會
隨著基因測序技術的發展，基因檢測的費用的降低，基因檢測應用到越來越多的生活場景中。這張圖概括了目前基因檢測的8大應用領域，分別是生殖健康，單基因遺傳病，腫瘤個體化診療，農林漁業的科研，心腦血管等慢性疾病，個性化藥物研發，消費性產品以及健康管理等方面。
二代測序的臨床應用分為四大塊，試管嬰兒，無創產檢，單基因遺傳病以及癌症的精準治療。其中腫瘤診斷成為最具潛力的應用市場，Illumina公司預測基因測序全球總市場容量為200億美元，其中腫瘤診斷佔比60%。同時，麥肯錫預測基因測序技術在肺癌、腸癌、乳腺癌和前列腺癌等領域的滲透率將高於20%。
基因測序市場還是有很大的機會，創業者只要找準一個方向，踏踏實實的做，就很容易和別人形成差別。
互動環節
Q：NGS跟數字PCR技術的結合點以及主要的應用在哪裡？
A：NGS跟數字PCR是一個比較互補的技術。NGS用在液體活檢裡面可以檢測到很多點，但是靈敏度不如數字PCR高。數字PCR是針對一些已知的點進行檢測，數據通量很小，但靈敏度高。所以在臨床未來的運用，我認為是先用NGS檢測出變異的點，再用數字PCR針對性的對這些點進行驗證，這樣的結合會比較有效果。
Q：昨天在火石的文章裡看到說納米孔測序技術的成本會有大幅降低，納米孔測序會是未來的方向嗎？
A：納米孔測序會是未來的方向，但目前來說，在短時間內可能性會小一些，而且能拿到的數據量也是比較有限的。
納米孔測序肯定會是未來的方向，因此也需要更多的投入，如果可以做成，相信會帶來整個測序的顛覆，包括現有的測序公司可能會有一個新的局面出來。
Q：面向C端的基因檢測服務目前存在的最大問題是什麼？
A：面向C端的基因檢測服務目前存在的問題我想一個是價格，測的東西多了價格自然也就高了，基因檢測服務還是屬於比較高端的產品；第二個是大眾的認知問題，檢測出來是真正能夠及時預防還是會造成恐慌，這個需要給消費者一定的時間；第三，最重要的還是技術層面的問題，基因檢測服務到底能給大眾帶來什麼，是否能真正預測未來的一些疾病，這是大家真正關心的。
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本文僅代表嘉賓個人觀點，與火石創造立場無關