文獻解讀 | 小鼠睪丸信使RNA切割

論文：MIWI and piRNA-mediated cleavage of messenger RNAs in mouse testes（MIWI和piRNA介導的小鼠睪丸信使RNA切割）

摘要

以介導轉座子的表觀遺傳沉默而聞名。最近的研究表明，這一功能也涉及到pRNA引導下轉座子轉錄本的切割。

由於許多pRNAs似乎也具有針對多種mRNAs的能力，這就提出了一種有趣的可能性，即piRNAs可能作為siRNAs廣泛地降解特定的mRNAs。

為了直接驗證這一假說，我們將小鼠PIWI(MIWI)相關的piRNAs與實驗鑑定的小鼠睪丸中切割的mRNA片段進行了比較，並觀察到主要發生在5『端5』端的切割位點。

我們還注意到在核苷酸位置1和10的U和A殘基在pRNAs和mRNA片段中的強烈偏倚，其特徵類似於「桌球」循環中的piRNA擴增模式。通過剪貼器-seq和基因表達譜分析，我們發現許多潛在的pRNA靶向mRNAs與miWI直接相互作用，並在睪丸中表現出較高的表達水平。

米維催化突變小鼠基於報告的分析進一步揭示了pRNAs與mRNA靶點之間鹼基配對的重要性，以及miWI在pRNA介導的靶抑制中對切割器活性和pRNA載量能力的要求。

重要的是，我們證明了某些關鍵的pRNA靶點的適當翻轉對於精子的形成是必不可少的。這些發現共同揭示了iRNA在小鼠睪丸中的作用及其對雄性生殖細胞發育和成熟的中心要求。

潛在的MIWI切割mRNA片段的鑑定

PIWI蛋白的切片活性是通過「桌球」機制和轉座子轉錄後沉默來進行pRNA擴增所必需的。

利用來自兩個對照成人睪丸的5『-種族分裂片段庫(米維+/−)和MIWI切片器活性缺失突變體(米維−/海德)小鼠我們選擇了一些片段，這些片段與RefSeq mRNAs的感覺鏈完全匹配，並將這些片段視為潛在的MIWI切割產物。

為了確保所有選擇的片段都來自於mRNAs，我們只包含了與小鼠基因組中唯一的位點相對應的片段。與野生型成年小鼠睪丸miWI相關的piRNAs庫，我們注意到潛在的pRNA結合位點與mRNA片段子集之間的位置關係。

如圖所示Psma 8, {「type」：「等號-核苷酸」，「atts」：{「text」：「BC 026590」，「Term_id」：「22382113」，「Term_Text」：「BC 026590」}}BC 026590和Mdc 1，推測的切割位點似乎與潛在的piRNA結合位點重疊，其切割位置恰好位於匹配的piRNAs 5『端的10 nt處。

piRNA介導的小鼠睪丸mRNA切割事件

上述潛在的MIWI/piRNA切割mRNA片段的例子促使我們詢問這種情況在小鼠睪丸中有多常見。為此，我們系統地篩選了在小鼠睪丸中表達的pRNAs的潛在mRNA靶點。

考慮到iRNA和mrna之間的完美或近乎完美的鹼基配對是miWI有效切割的必要條件。我們首先尋找鹼基配對，在第2至21位的pRNA與mRNA之間的錯配不到3次(見下面針對pRNA的鹼基配對規則)。

接下來，我們研究了在5『-種族文庫中發現的5』端mRNA片段附近潛在的pRNA結合位點的分布情況。與之前的觀察一致，MIWI在10 nt位置將目標從目標pRNAs的5『端處切割出來。

我們觀察到5『端位於切割位點下遊10 nt位置的匹配的pRNAs有很強的富集。圖2A)。相反，從米維−/海德小鼠睪丸(圖2B)，提示MIWI的切片活性對這類mRNA片段的產生是必不可少的。

如果我們只計算mRNA片段而不是靶向的pRNAs，我們就得到了類似的結果。補充資料，圖S2A)。

我們共鑑定了1,878個pna：mrna相互作用，其基礎是在第10位米維+/−小鼠睪丸(圖2A, 表1和補充資料，表S1)，共涉及1295個非冗餘的piRNAs和193個mRNA片段。我們認為這193個位於169個特定蛋白編碼基因中的片段是潛在的pRNA靶點.

MIWI介導的剪貼器對mRNA切割調控的分析

為了為miWI/piRNA介導的小鼠睪丸mRNA切割調控提供實驗依據，我們進行了miwi剪貼器seq，正如我們最近描述的。以確定MIWI與RNA之間的物理相互作用。

考慮到我們先前的研究結果，我們發現大量的MIWI及其相關的pRNAs存在於圓形精子細胞中。我們對從成年小鼠睪丸中分離出來的圓形精子細胞進行了MIWI剪輯-seq。補充資料，圖S4A)。

我們發現∼有4800萬的讀取數據可以被映射到老鼠的基因組上。考慮長度為25-33nt的閱讀為piRNAs，較長的讀(序列為36 nt)為MIWI限制的目標RNA(圖3A我們發現，共有1,700萬個∼對應於pRNAs，∼1,000萬讀對應於MIWI目標。

重要的是，雖然大多數miWI結合的piRNAs和目標來源於各種含有重複序列的轉錄本和長時間的非編碼RNAs(IncRNAs)，但很大一部分讀子也被映射到蛋白質編碼基因的感覺鏈(圖3B).

PRNA靶位點的特徵

我們進一步分析了193個預測的piRNA靶位點(補充資料，表S1)，並發現大部分這些位點(∼75%)被多個pna(圖5A)。

有趣的是，我們發現超過70%的潛在目標位點位於3『-UTRs(圖5B儘管HAT 3『-UTR序列僅佔5』-RACE文庫中所有∼片段的30%，提示pRNA靶位點優先位於目標mRNA的3『-UTRs中。

討論

綜上所述，本研究結合計算與實驗相結合的方法，通過分析序列互補、靶位點位置以及與目標位點相匹配的piRNA讀取，推導出pRNA：mRNA相互作用的規律。

儘管我們所推導的規則還有待進一步完善，但我們的數據表明，pRNA：mrna之間的相互作用要求

(1)piRNA與mRNAs之間存在最小的∼16-nt連續互補，

(2)在pIRNA的5『端有嚴格的鹼基配對，

(3)在隨後的20個nt序列中，<3錯配；

(4)將3』-UTRs保守為首選的pIRNA靶位點；

(5)在針對特定mRNAs的pRNAs中的第1和第10位富集U和A殘基。

鑑於數以百萬計的piRNA在小鼠睪丸中表達，其在沉默轉座子中的作用已經得到了充分的證實。

因此，在未來的研究中，確定pRNA機制的哪一部分致力於保護基因組不受轉座子的影響，以及哪一部分參與蛋白質編碼基因的調控，以及這兩個過程在哺乳動物雄性生殖細胞發育的不同階段相互協調，將具有重要意義。

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