文獻解讀 | 轉錄延伸調節pRNA生成位點的一個子集

論文：BTBD18 Regulates a Subset of piRNA-Generating Loci through Transcription Elongation in Mice（Btbd 18通過轉錄延伸調節pRNA生成位點的一個子集）

摘要

Piwi相互作用RNA(PiRNAs)是動物生殖細胞發育所必需的非編碼小RNA。儘管對轉錄後處理過程進行了大量的研究，但用於哺乳動物pRNA生物發生的染色質調節因子仍有很大一部分未被探索。

在此，我們發現BTBD 18是小鼠睪丸中的一種粗線核蛋白，佔據了粗線pRNA產生位點的一個子集。燒蝕Btbd 18在小鼠中破壞了pRNA的生物合成，阻止精子發生，並導致雄性不育。

轉錄組分析、染色質可及性和RNA聚合酶II的佔據情況表明，BTBD 18通過促進轉錄伸長促進粗線型piRNA前體的表達。因此，我們的研究發現BTBD 18是通過RNA聚合酶II延伸到基因組pRNA位點上激活轉錄的特異性調控因子。

凋亡細胞在減數分裂後期出現，而生殖細胞的發育在圓形精子細胞期被阻斷

Btbd 18基因編碼一種進化保守的蛋白質。我們最初關注的是btbd 18，認為它是一種在早期胚胎發生中很有希望的重編程因子，因為在全能的2-細胞胚胎中轉錄本的豐度很高。

另見Unigene中的表達譜和蛋白質的核定位。為了闡明其在發育過程中的作用，我們通過基因靶向基因第5外顯子，產生了基因敲除小鼠。Btbd 18若要刪除大部分編碼序列，請執行以下操作。

雜合子(+/−)Btbd 18零小鼠產生具有預期孟德爾比率的幼犬。正常出現純合子(−/−)缺失小鼠是通過將純合空雌小鼠與雜合子雄性空鼠交配而產生的，表明在BTBD 18缺失的情況下，正常胚胎發生是正常的。

令人意外的是，當純合空雄性與雜合或純合子的雌性小鼠共籠時，沒有產生幼仔，證明Btbd 18突變雄性不育。因此，我們從對照組(雜合子)和Btbd 18零(純合子)雄性，並發現突變睪丸明顯小於對照組，提示精子發生異常。

在精子發生過程中，精原細胞分化為精母細胞，分化為單倍體圓形精子細胞，啟動精子發生，形成成熟精子。組織學檢查顯示Btbd 18在輪狀精子細胞期發生減數分裂後阻滯，顯著減少圓形精子細胞的形成。

TUNEL分析顯示，突變的生精管細胞凋亡顯著增加。對突變的生精小管的進一步顯微觀察表明，生殖細胞在精母細胞晚期開始凋亡。對照和對照減數分裂染色體傳播的免疫染色Btbd 18零精母細胞證實在沒有BTBD 18的情況下，突觸和重組成功。

因為p53通路經常被激活，在應激反應中觸發細胞凋亡，所以我們產生了Btbd 18零老鼠在p53零背景。然而，雙基因敲除小鼠的精子發生失敗。提示p5 3不依賴於p5 3的通路參與生殖細胞的清除。Btbd 18零老鼠。

BTBD18是小鼠睪丸中的粗線核蛋白

調查Btbd 18在精子發生過程中，我們根據以前報導的小鼠rna-seq數據，分析了睪丸內的主要細胞類型。

我們發現Btbd 18從精原細胞到精子細胞均有轉錄本，成熟精子和支持細胞中均有微量表達。為了進一步研究BTBD 18蛋白在小鼠體內的表達，我們構建了表達BTBD 18的轉基因小鼠。

Btbd 18轉錄起始位點上遊3.2kb序列的cDNA作為啟動子。將轉基因BTBD 18標記為N端標記和C端mCherry標記進行鑑定。我們第一次證明轉基因的表達挽救了我們觀察到的精子發生和生育缺陷。

Btbd 18零老鼠。這表明Btbd 18是專門針對敲除線的，並且Btbd 18旗/櫻桃內源基因的轉基因替代物Btbd 18基因。然後我們問到BTBD 18在哪裡旗/櫻桃蛋白質定位於小鼠睪丸。

雖然新製備的精小管或冷凍睪丸切片中的螢光信號低於檢測值，但用抗mCherry抗體對冷凍睪丸切片進行免疫染色，發現粗線精母細胞核內有特異性的免疫螢光。

BTBD 18對粗線piRNA基因座轉錄伸長的促進作用

為了確定BTBD 18是如何調控其靶向pRNA前體轉錄的，我們研究了這些基因組位點上的染色質結構。為了檢測染色質可達性的變化，我們對新鮮分離的精母細胞進行轉座酶可達染色質測序(ATAC-seq)。

在對照精母細胞中，常出現一個以粗線piRNA前體TSS為中心的尖峰，隨後出現一個寬峰進入轉錄單位。在沒有BTBD 18的情況下，PP-BD基因體上的染色質結構被嚴重破壞，支持BTBD 18在調節轉錄活性而不是轉錄穩定性方面發揮作用。

然而，儘管BTBD 18缺失，但PP-BD基因TSS周圍的染色質區仍可接近，提示BTBD 18在啟動子開啟後轉錄機制組裝中的調控作用。因此，我們進行了晶片-seq分析，以了解POLⅡ在控制系統中的佔用率。

Btbd 18零睪丸細胞。與ATAC-seq結果一致的是，在沒有btbd 18的情況下，pp-bd基因座中POLⅡ的延伸明顯局限於tsss周圍的基因組區。

表示非生產性伸長率.這一結果證明了5『檢查點的存在，因為POLⅡ在早期伸長過程中離開了piRNA前體的啟動子，BTBD 18在沒有適當的許可信號的情況下停止了轉錄。

討論

不同的pRNA前體對BTBD 18的反應提示不同的染色質標誌和轉錄控制在離散的piRNA位點。我們研究了不同的組蛋白修飾三個群體的pRNA前體基因位點。

有趣的是，賴氨酸乙醯化和巴頓化在PP-BI和PP-BD群體中表現出顯著性差異，確定BTBD 18是否與這些修飾相互作用，以及BTBD 18與這些修飾的相互作用方式將是很有趣的。

此外，已知含有btb的蛋白質與cullin相互作用，組裝E3連接酶並介導蛋白泛素化。這增加了BTBD 18也可能介導組蛋白H2B泛素化以促進RNA POLⅡ的延伸。

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