編者按
毋庸置疑，基因轉錄的精細調控是細胞生命活動的核心，然而圍繞RNA聚合酶Pol II的C端結構域CTD的磷酸化是如何被精細調控的很長一段時間都是領域內的關鍵科學問題，過去更多的是比較清楚CTD如何被加上磷酸化開啟轉錄調控，但是CTD的磷酸化如何精細的被去除從而抑制轉錄的相關研究相對缺乏。今日在線的Science論文首次發現PP2A這一最重要的磷酸酶可與Integrator複合物形成一個全新的轉錄調控複合物 INTAC直接調控轉錄，拓展了轉錄調控和PP2A相關領域的研究邊界。有鑑於此，BioArt特別邀請到了長期從事磷酸酶相關研究的馮新華教授和長期從事轉錄調控研究的朱冰教授點評，以饗讀者！
點評 | 馮新華（浙江大學生命科學研究院）、朱冰（中科院生物物理所）
責編丨迦漵
基因表達的精密調控，對生命體的形成、發育以及各種生物學功能的維持至關重要；基因表達的紊亂，與各種疾病的發生息息相關。轉錄是基因表達的最核心步驟。真核生物的轉錄過程主要分為轉錄起始（initiation）、暫停（pausing）、延伸（elongation）和終止（termination）四個步驟。RNA聚合酶II （Pol II）在轉錄進程中，受到轉錄因子和Pol II本身的翻譯後修飾調節。哺乳生物中Pol II的C端結構域（C-Terminal Domain，CTD）由52個七肽重複序列組成，它的不同位點的磷酸化和去磷酸化的動態調控與Pol II的轉錄進程緊密相連【1,2】。比如，CDK7催化的CTD第五位絲氨酸（pSer5）的磷酸化調控了轉錄暫停，而CDK9和CDK12/13共同調控的CTD第二位絲氨酸的磷酸化（pSer2）調控了轉錄延伸和終止【3】。
相對於對調節CTD磷酸化的激酶的廣泛研究，人們對CTD動態調控中的去磷酸化卻知之甚少。轉錄過程複雜性的另一方面體現在RNA產物的剪切過程，代表性分子如Integrator複合物能夠剪切暫停狀態下Pol II所合成的RNA促進轉錄終止【4】。但Integrator剪切功能如何發生仍不清楚。尤其是RNA剪切與Pol II磷酸化調控的相互關聯性，極少有報導。
2020年11月27日，復旦大學徐彥輝課題組和陳飛課題組合作在Science雜誌在線發表題為Identification of Integrator-PP2A complex (INTAC), an RNA Polymerase II phosphatase的研究長文（Research Article）。該項研究發現了一個全新的轉錄調控複合物 INTAC（16個亞基，分子量近1.5MDa），解析了INTAC的高分辨冷凍電鏡結構，揭示了INTAC作為一個雙功能酶，同時具備RNA剪切和去磷酸化活性，可去除Pol II的多個CTD磷酸化位點發揮轉錄抑制功能。該項研究首次發現PP2A這一最重要的磷酸酶可直接調控轉錄，拓展了這兩個重要研究領域的研究範疇。
Integrator含有14個亞基（分子量1.4MDa），結合Pol II，剪切多種RNA並調控轉錄。研究團隊在開展Integrator結構研究過程中，發現Integrator和PP2A核心酶（PP2A-AC）有較強的相互作用。通過系統生化和結構研究，驗證了二者形成穩定的功能複合物，並將其命名為INTAC（Integrator-containing PP2A-AC），屬於非經典的PP2A全酶複合物（見下圖）。
PP2A是人體中最重要的蛋白質磷酸酶之一，在某些組織中其含量甚至達到總蛋白量的1%。在細胞內調控多種生命過程並參與多種疾病的發生，但以往沒有PP2A直接參與轉錄調控的報導。研究團隊解析了INTAC的高分辨結構（整體解析度3.5 ），發現核酸酶（Endonuclease）和磷酸酶（Phosphatase）這兩個催化模塊分布在核心的骨架模塊兩側。進一步的生化研究發現，INTAC中的PP2A-AC去除Pol II CTD磷酸化並抑制轉錄活性。其中Integrator作為非經典的調控亞基，招募Pol II，使PP2A-AC發揮去磷酸化活性。INTAC的磷酸酶與核酸酶的活性分別調控轉錄的不同過程，即核酸酶活性主要調控基因的啟動子近端終止，而去磷酸化酶活性則能夠同時抑制暫停Pol II的釋放和轉錄延伸。
該項工作明確了PP2A直接調控基因轉錄，不僅拓展了轉錄調控和PP2A相關領域的研究邊界，也對靶向PP2A的藥物開發提出了重要的指導。以往的PP2A靶向藥物開發都只關注其調控信號通路的作用，後續的開發就需要考慮其直接調控轉錄的功能。
圖註：INTAC複合物的分子組成和工作模型。（左上）經典的蛋白磷酸酶2（PP2A全酶）的分子組成示意圖，A、B和C分別代表PP2A全酶的結構亞基，調節亞基和催化亞基。PP2A全酶可間接調控轉錄。（右上）INTAC複合物的分子組成示意圖和電鏡密度圖。複合物由四個模塊組成，可直接調控轉錄。（底部）INTAC複合物結合RNA聚合酶Pol II並去除Pol II CTD的第2、5和7位絲氨酸的磷酸化，進而抑制轉錄過程。而磷酸酶活性的損失則增加了Pol II磷酸化的水平，從而導致INTAC目標基因失調的轉錄。
值得一提的是，徐彥輝教授早年在博後期間（導師為施一公教授）最主要的工作就是圍繞蛋白質磷酸酶PP2A的結構與工作做了大量重要的工作，闡明了PP2A發揮功能的結構基礎及其在腫瘤發生中的作用機理【5-8】（Cell，2006a，2006b；NSMB，2007；Mol Cell，2008），沒想到14年後，徐彥輝教授團隊在解析負責RNA產物剪切的Integrator複合物的重要研究中再次邂逅了PP2A，正所謂朱冰老師在點評中提到提到的「兜兜轉轉，人生何處不相逢」。
本次Science論文的另一位通訊作者陳飛研究員是徐彥輝課題組早年畢業的碩士，之後在在美國西北大學醫學院Ali Shilatifard實驗室完成表觀遺傳學和基因表達方向的博士訓練，還在Memorial Sloan Kettering Cancer Center的Joan Massague（TGF-β信號轉導與腫瘤轉移研究領域的執牛耳者 ）實驗室完成腫瘤轉移和信號轉導方面的博士後訓練，在Cell、Science、Mol Cel、Gene & Dev上以第一作者發表過多篇研究論文，在上述背景之下，徐彥輝組和陳飛組的合作配合是非常契合的。
總的來說，這篇Science最值得稱道的地方還在於前文提到的「首次明確了PP2A直接調控基因轉錄，拓展了轉錄調控和PP2A相關領域的研究邊界，還對靶向PP2A的藥物開發提出了重要的指導」，這是一篇結構解析與生物學功能研究結合完美的典範之作，該工作也是徐彥輝課題組繼年初在Science上發表研究長文揭示人源BAF複合物的染色質重塑機制（詳見BioArt報導：Science丨徐彥輝團隊揭示人源BAF複合物的染色質重塑機制）之後，在轉錄調控相關結構功能研究中收穫的又一次重量級成果。
據悉，復旦大學附屬腫瘤醫院博士後鄭海、復旦大學生物醫學研究院2017級博士生戚軼倫、助理研究員胡士斌、博士後徐從玲、中科院上海營養與健康研究院博士後曹璇為本文共同第一作者，徐彥輝和陳飛為共同通訊作者。
原文連結：https://science.sciencemag.org/content/370/6520/eabb5872
專家點評
馮新華（浙江大學生命科學研究院教授、浙江大學求是講席教授）
RNA Pol II的C端結構域（carboxy-terminaldomain，CTD）具有調控轉錄和RNA加工的重要功能。人類Pol II的CTD包含了52個Y1S2P3T4S5P6S7重複序列，不同程度的翻譯後修飾組合定量地決定著特定基因轉錄的起始、延伸和終止。細胞以何種機制在時空上精準地調控CTD磷酸化狀態是長久以來的一個重要科學問題。目前已知的CTD激酶包括CDK7、CDK9、CDK12、CDK13、GSK3b、ERK1/2和DYRK1A等；其中CDK7（TFIIH亞基）負責催化第五位絲氨酸磷酸化(P-Ser5)，CDK9（P-TEFb亞基）負責催化第二位絲氨酸磷酸化(P-Ser2)。此外，磷酸酶FCP1、SCP1、RPAP2和SSU72等負責擦除CTD上的磷酸化修飾。這些激酶和磷酸酶協同作用，共同譜寫了基因轉錄過程中的「CTD磷酸化交響曲」。
UC Berkeley周強實驗室的工作表明，CTD磷酸化狀態通過相分離形成轉錄的功能區室，這些具有不同功能的相變區室共同組成了「CTD磷酸化交響曲」的各個樂章(Lu et al. 2018)（Nature | 相分離調控轉錄起始至轉錄延伸的轉換過程）。因此，闡明CTD發生動態修飾的分子機制可以幫助我們更好地理解各個樂章之間的相互轉換。
Integrator多亞基複合物在多細胞生物中具有高度保守性，包含至少14個INTS亞基。2005年的一項研究發現，Integrator能夠與Pol II CTD結合，並通過其RNA核酸內切酶活性介導了核內小RNA（small nuclear RNAs，snRNAs）3』端的加工。隨後的研究發現Integrator還能參與轉錄阻滯釋放、轉錄延伸、增強子RNA（eRNA）轉錄等過程，提示Integrator具有不依賴核酸內切酶活性的轉錄調控功能。
但是，受限於它的組成複雜，樣品的不易獲得，近年來關於Integrator複合物的機制研究相對滯後。猶如盲人摸象，我們目前只了解Integrator一些獨立組分的結構，但對於整個複合物的全貌我們還知之甚少。最近，徐彥輝實驗室(Zheng et al. 2020)和Wagner實驗室(Huang et al. 2020)分別發現Integrator複合物具有招募磷酸酶PP2A，從而結合Pol II CTD並去除其Ser2/5/7磷酸化的功能。
徐彥輝課題組和陳飛課題組合作的最新Science文章（「Identification and of Integrator-PP2A complex（INTAC）, an RNA Polymerase II phosphatase」），從結構生物學和生物化學的角度，給整個Integrator複合物的結構和功能繪製了一個全貌信息：Integrator能夠與蛋白質磷酸酶PP2A形成複合物INTAC，除了發揮已知的RNA核酸內切酶的功能外，還在轉錄過程中完成對CTD的去磷酸化，從而影響轉錄的不同階段。INTAC複合物的冷凍電鏡結構（解析度3.5）顯示，它包含PP2A的A亞基和C亞基，沒有傳統的PP2A全酶的調控亞基B（或者B』、B』』、B』』』）。
因此，Integrator複合體充當了PP2A的調節亞基角色，其中INTS5，INTS6，INTS8亞基直接結合在PP2A-AC核心酶上，組裝成為INTAC複合物中的磷酸化酶模塊。而Wagner的生化實驗認為INTS8招募PP2A到RNA Pol II，但是缺乏關鍵的體外重組蛋白實驗展示INTS8-PP2A相互作用，更缺乏結構生物學數據的支持INTS8究竟是獨立地還是以Integrator複合體的形式發揮作用。
徐彥輝團隊的工作更為全面和精確，他們的發現提供了INTAC複合物的高解析度結構，全面地展示了Integrator複合體與PP2A核心酶相互作用並裝配為非經典PP2A全酶。生化和細胞水平實驗進一步揭示了INTAC中PP2A介導Pol II CTD去磷酸化並調控基因轉錄的機制。這項研究不僅提示了PP2A生物學功能的廣譜性，也為後續研究磷酸酶和RNA核酸內切酶在轉錄過程中獨立及協同作用的調控機制起到了很好的範式作用。
最後，這項研究也帶來了新的思考，PP2A是否還存在新型的調節亞基（如其它複合物、RNA等）？INTAC是否還有CTD相聯繫或其它的底物？INTAC活性在不同的細胞類型、不同的細胞狀態（如細胞周期）以及不同的器官發育階段如何調控？不同的CTD磷酸酶如何在時空上協調它們的作用？在不同的物種裡和進化長河中這些CTD磷酸酶如何獲得現在的角色？這些問題尚有待進一步探討。
References：
Lu H et al. 2018. Phase-separation mechanism forC-terminal hyperphosphorylation of RNA polymerase II. Nature,558(7709):318-323.
Zheng et al. 2020. Identification of integrator-PP2Acomplex (INTAC), an RNA polymerase II phosphatase. Science, 370(6520),esbb5872.
Huang et al. 2020. Integrator recruits proteinphosphatase 2A to prevent pause release and facilitate transcriptiontermination. Molecular Cell, 80(2):175-376
朱冰（中科院生物物理所研究員）
兜兜轉轉，人生何處不相逢
RNA聚合酶II最大的亞基有一個奇特的C端結構域 (CTD)，一個七肽序列YSPTSPS在人源的CTD中重複多達52次，其中富含可供磷酸化的胺基酸殘基。該序列中第5位和第2位絲氨酸殘基上的磷酸化修飾相對最耳熟能詳，因為前者是轉錄起始階段RNA聚合酶II的特徵，而後者則是轉錄延伸階段RNA聚合酶II的特徵。
徐彥輝組的這一工作非常有意思，他們純化鑑定了INTAC複合體並解析了其結構和組裝機制。INTAC複合體含有兩個部分：參與轉錄調控的Integrator複合體和去磷酸化酶PP2A複合體的核心酶（PP2A-A和PP2A-C）。Integrator複合體最初是2005年由我師兄Ramin Shiekhattar課題組純化鑑定的，當時他們用CTD和細胞核抽提物進行親和純化，得到了Integrator複合體。Integrator和CTD結合緊密，又和去磷酸化酶PP2A結合緊密，再加上CTD高度磷酸化，這顯然將INTAC複合體的去磷酸化酶活性的底物指向了CTD。果然，徐彥輝組證明INTAC在體外和體內都能導致CTD的去磷酸化，並進一步分析了其對轉錄調節的功能。當然，INTAC究竟主要在轉錄的什麼階段利用其去磷酸化酶活性來調控轉錄將會是今後值得深入研究的方向。
這是一個工作量很大的工作，按理很可能可以作為兩篇Science來發表（BioArt註：經求證，事實上一開始是按照兩篇論文同時投稿最後合併為一篇15頁的研究長文 ），一篇聚焦INTAC複合體的純化鑑定和功能分析，一篇聚焦INTAC複合體的結構（畢竟Integrator複合體的結構也尚未得到解析）。兩個工作最終合二為一，說明一來科學家們能做的事情越來越多，二來科學家們必須做的事情也越來越多。這也許就是Whatever possible has to be done吧。
最後，這一工作的花絮是徐彥輝教授在博士後期間的主要研究成果就是PP2A全酶複合體的結構，他獨立以後在表觀遺傳修飾和轉錄調控相關的結構生物學研究方面做了大量出色的工作。而這次是從轉錄又回頭遇見了PP2A，真所謂「兜兜轉轉，人生何處不相逢」。
參考文獻
1. F. X. Chen, E. R. Smith, A. Shilatifard, Born to run: control of transcription elongation by RNA polymerase II. Nat Rev Mol Cell Biol19, 464-478 (2018).
2. I. Jonkers, J. T. Lis, Getting up to speed with transcription elongation by RNA polymerase II. Nat Rev Mol Cell Biol 16, 167-177 (2015).
3. D. E. Lyons, S. McMahon, M. Ott, A combinatorial view of old and new RNA polymerase II modifications. Transcription 11, 66-82 (2020).
4. M. S. Mendoza-Figueroa, D. C. Tatomer, J. E. Wilusz, The Integrator Complex in Transcription and Development.Trends in biochemical sciences, (2020).
5. Xu, Y. #, Xing, Y. #, Chen, Y. #, Chao, Y. #, Lin, Z., Fan, E., Yu, J.W., Strack, S., Jeffrey, P.D. and Shi, Y. (2006) Structure of the protein phosphatase 2A holoenzyme. Cell 127, 1239-1251.
6. Xing, Y. #, Xu, Y. #, Chen, Y. #, Jeffrey, P.D., Chao, Y., Lin, Z., Li, Z., Strack, S., Stock, J.B. and Shi, Y. (2006) Structure of protein phosphatase 2A core enzyme bound to tumor-inducing toxins.Cell 127, 341-353.
7. Chen, Y. #, Xu, Y. #, Bao, Q., Xing, Y., Li, Z., Lin, Z., Stock, J.B., Jeffrey, P.D. and Shi, Y. (2007) Structural and biochemical insights into the regulation of protein phosphatase 2A by small t antigen of SV40. Nature structural & molecular biology14, 527-534.
8. Xu, Y. #, Chen, Y. #, Zhang, P., Jeffrey, P.D. and Shi, Y. (2008) Structure of a protein phosphatase 2A holoenzyme: insights into B55-mediated Tau dephosphorylation. Molecular Cell 31, 873-885.