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最新在中心上線的發表在Cell Press細胞出版社旗下期刊Cell上，名為"Structural basis for helicase-polymerase coupling in the SARS-CoV-2 replication-transcription complex"的研究論文，研究人員描述了SARS-CoV-2 RdRp全酶及其與一個RNA模板產物和兩個nsp13解旋酶分子形成複合的冷凍電鏡結構。每個nsp13的套式病毒目特異性的N端結構域與每個nsp8拷貝的N端延伸交聯。每個nsp13也與nsp12相接觸。該結構將解旋酶的核酸結合ATP酶結構域直接置於複製轉錄的RdRp全酶前，從而限制nsp13發揮其功能。他們還觀察到ADP-Mg2+與nsp12 N端套式病毒RdRp相關核苷酸轉移酶結構域相結合，為抗病毒治療發展提供了全新機會。
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摘要
SARS-CoV-2是2019-2020年暴發的大流行的病原體。SARS-CoV-2基因組在複製和轉錄時需要RNA依賴性RNA聚合酶全酶（Holo-RdRp, 由亞基nsp7 / nsp82 / nsp12組成）和一系列輔因子。其中一種輔因子是nsp13解旋酶。Holo-RdRp和nsp13是病毒複製所必需的，並且也是治療COVID-19的靶點。在此，我們描述了SARS-CoV-2 RdRp全酶及其與一個RNA模板產物和兩個nsp13解旋酶分子形成複合的冷凍電鏡結構。每個nsp13的套式病毒目特異性的N端結構域（The Nidovirus-order-specific N-terminal domains）與每個nsp8拷貝的N端延伸交聯。每個nsp13也與nsp12相接觸。該結構將解旋酶的核酸結合ATP酶結構域直接置於複製轉錄的RdRp全酶前，從而限制nsp13發揮其功能。我們還觀察到ADP-Mg2+與nsp12 N端套式病毒RdRp相關核苷酸轉移酶結構域（nsp12 N-terminal nidovirus RdRp-associated nucleotidyltransferase domain）相結合，為抗病毒治療發展提供了全新機會。
簡介
冠狀病毒（CoVs）是屬於套式病毒目（order Nidovirales）的正鏈RNA（+RNA）病毒（de Groot et al., 2012）。套式病毒目具有已知的最大RNA基因組（Nga et al., 2011; Saberi et al., 2018）。套式病毒的RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp，由第12號非結構蛋白所編碼，即nsp12）在RdRp全酶（包含nsp7/nsp82/nsp12三個亞基）中發揮作用，用以合成所有的病毒RNA分子（Kirchdoerfer and Ward, 2019; Subissi et al., 2014）。RdRp是多種抗病毒藥物的作用靶點，例如瑞德西韋（Agostini et al., 2018; Yin et al., 2020）。除了具有在病毒基因組複製和轉錄中的核心作用之外，RdRp還包含一個N端套式病毒RdRp相關核苷酸轉移酶（NiRAN）結構域，其功能未知，但這種酶的激活對於病毒繁殖來說是必不可少的（Lehmann et al., 2015a）。
在病毒的生命周期中，holo-RdRp與許多輔因子互相協調（Snijder et al., 2016; Sola et al., 2015）。其中一種輔因子是nsp13，一種超家族1B（SF1B）解旋酶，能以NTP依賴的方式使DNA或RNA從5'端向3'端解開（Ivanov and Ziebuhr, 2004; Lee et al., 2010; Seybert et al., 2000a, 2000b;Tanner et al., 2003）。該解旋酶對於馬動脈炎病毒（EAV）（Dinten et al., 2000; Seybert et al., 2000a, 2005）和β-CoV鼠肝炎病毒（Zhang et al. 2015）——兩種套式病毒的複製至關重要。推測該解旋酶在所有套式病毒中都是必需的（Lehmann et al., 2015b）。研究者認為解旋酶在病毒生命周期的許多方面都起著至關重要的作用，其中一些可通過點突變進行解耦合（Dinten et al., 1996; Marle et al., 1999）。除了具有解旋酶的活性外，nsp13還可能在mRNA加帽中發揮RNA 5'-三磷酸酶的作用（Ivanov and Ziebuhr, 2004; Ivanov et al., 2004）。
除了SF1解旋酶的兩個典型RecA ATP酶結構域（Saikrishnan et al., 2009; Singleton et al., 2007）外，nsp13還包含三種套式病毒解旋酶特有的結構域——一個N端鋅結合域（ZBD）、莖，以及一個1B域（Hao et al., 2017; Jia et al., 2019; Lehmann et al., 2015b）。這些結構域對於nsp13體內功能的作用尚不清楚，但是在這些結構域中發生的取代，或者它們之間的連接，對體外解旋酶活性以及病毒繁殖具有破壞性作用（Dinten et al., 1996, 2000; Hao et al.,2017; Marle et al., 1999; Seybert et al., 2005）。
生化和生物物理研究表明nsp13和nsp12之間有相互作用（Adedeji et al.,2012; Jia et al., 2019），但人們尚未通過化學方法分離得到其穩定的複合物或表徵其結構，而且解旋酶在SARS-CoV-2複製轉錄中的機械作用仍是未知。在此，我們製備得到了穩定的nsp13:holo-RdRp:RNA複合體（稱為nsp13-複製/轉錄複合體，nsp13-RTC），並通過冷凍電子顯微鏡確定了解析度為3.5Å的結構。該複合體的體系結構限制了nsp13發揮功能的模式，並提示了nsp13其他可能存在的作用，例如產生用於進行校對的回溯複製/轉錄複合物、在亞基因組RNA轉錄過程中進行模板切換，或兩種功能兼備。我們的分析還發現了套式病毒特異性NiRAN結構域活性位點中的ADP-Mg2+複合結構，為抗病毒治療的發展提供了新的空間。
討論
我們發現了SARS-CoV-2複製/轉錄的關鍵成分——nsp13和holo-RdRp形成的穩定複合物，並確定了其標稱解析度為3.5Å的冷凍電鏡重建結構。在該結構中，解旋酶與RTC相互作用的主要決定因素發生在nsp13-ZBD和nsp8-延伸序列之間。這兩種結構元件都是套式病毒特有的，並且在α冠狀病毒和β冠狀病毒屬中，其相互作用位點在序列上具有保守性，表明這種相互作用對SARS-CoV-2的複製/轉錄十分關鍵。對SARS-CoV-1開放閱讀窗集合（ORFeome）的蛋白相互作用分析確定了nsp8是病毒蛋白相互作用的中心樞紐（Brunn et al., 2007），這也概括了我們在本研究中觀察到的nsp13-RTC相互作用。nsp8a和nsp8b的結構體系具有較長的N端螺旋延伸，為一系列複製/轉錄因子的結合提供了較大的結合表面。
我們的結構分析還表明，ADP與蛋白質之間無鹼基特異的相互作用。nsp12-NiRAN-H75與腺嘌呤鹼基形成陽離子-π相互作用，但是這種相互作用並不會強烈地依賴於鹼基特異性。NiRAN結構域中對應H75的位置An序列不保守，表明：i）該殘基不是NiRAN域活性位點鹼基特異性的決定因素；ii）不同套式病毒中NiRAN域的鹼基特異性不同，或iii）NiRAN域在激活時通常不表現鹼基特異性。我們注意到，NiRAN域的酶促活性對於病毒繁殖是必不可少的，但其靶點尚不清楚（Lehmann et al., 2015a）。我們還需要進一步的實驗來更充分地了解NiRAN域的活性、其優選的底物及其體內靶點，並且這些可能在不同套式病毒中也有所不同。我們的研究結果為生化、生物物理和遺傳實驗探究這些問題提供了結構基礎，並且也有助於抗病毒治療平臺的開發。
我們對病毒RdRps與細胞DdRps進行了比較分析，結果表明，聚合酶活性位點具有顯著的結構相似性——緊鄰每個聚合酶活性位點的下遊是一個保守的結構元件，將活性位點裂隙分成兩個部分，將下遊核酸模板引導至其中一個部分，並在另一部分留出相對開放的通道（次要通道）。在細胞DdRps中，劃分活性位點裂隙的保守結構元件是橋螺旋（Lane and Darst, 2010），次要通道用於使NTP底物進入DdRp活性位點，並容納回溯過程中產生的單鏈3'-RNA片段。
我們對nsp13-RTC的結構分析表明，nsp13.1可以與下遊的單鏈t-RNA結合。與RdRp在RNA鏈上3'-> 5'方向的移位相反，解旋酶在同一條RNA鏈上的移位自5'-> 3'方向進行。解旋酶的這種功能可以提供回溯RdRp所必需的NTP依賴性運動活性。在細胞生物中，DdRp回溯在許多過程中起著重要作用，包括控制轉錄延長的暫停及終止、DNA修復和維持保真度等（Nudler, 2012）。SARS-CoV-2複製/轉錄中的回溯可能有兩種作用，包括：1）維持保真度；2）亞基因組轉錄過程中的模板轉換。
大型套式病毒RNA基因組的複製和維持（Nga et al., 2011; Saberi et al., 2018）是該類病毒的特點。這些病毒編碼一系列獨特的校對活動，但是這些活動在其他RNA病毒中卻沒有發現（Minskaia et al., 2006）。這包括nsp14的N端核酸外切酶（ExoN）結構域，它與其輔因子nsp10一起在病毒複製過程中形成了重要的RNA校對機制（Denison et al., 2011; Smith et al., 2014）。我們提出，nsp14可以通過其在RdRp次級通道處的ExoN活性位點結合holo-RdRp，而且nsp14會在此處遇到回溯錯配的RNA 3'端。因此，通過將錯配的RNA 3'端擠出到nsp14 ExoN活性位點進行切割，解旋酶驅動的回溯可以在維持複製/轉錄的保真度中發揮作用。
阻礙細胞DdRps向前移位也可能誘發回溯（Nudler, 2012）。瑞德西韋（Rdv）是一種腺苷三磷酸核苷類似物，已獲得美國食品藥品監督管理局的緊急使用授權，用於治療COVID-19（U.S. FDA, 2020; Warren et al., 2016）。Rdv通過RdRp整合至p-RNA中，並且似乎通過延遲鏈終止機制發揮抗病毒作用。Rdv摻入後最多可添加三個核苷酸，直到進一步的正向移位停止（Gordon et al., 2020）。nsp14 ExoN無法接近摻入至RNA雙鏈-4位置的Rdv並產生激活後的作用，但是缺乏nsp14 ExoN活性的冠狀病毒突變體對Rdv更為敏感（Agostini et al., 2018），表明nsp14 ExoN的激活可以鈍化藥物的有效性（Shannon et al., 2020）。回溯過程可以促進nsp14 ExoN用於切除Rdv的校對活性，這使得nsp14從3'端降解p-RNA，直到去除Rdv。
holo-RdRp協調下遊鏈延長障礙的效率仍是一個位置的問題。我們的結構表明，nsp13解旋酶可能在t-RNA上以5'-> 3'方向發揮作用，破壞穩定的RNA次級結構或下遊RNA結合蛋白，這兩種情況都可能對RNA的延長造成重大阻礙。解旋酶可能分散地發揮其作用，從而避免幹擾RdRp移位。另外，在使用全雙鏈RNA模板的情況下，該解旋酶可以像複製性解旋酶一樣，依次解開下遊的雙鏈RNA，就像大腸桿菌中的DnaB，在複製性DNA聚合酶前依序解開DNA雙鏈（Kaplan and O'Donnell, 2002）。
除了套式病毒外，許多RNA病毒，包括基孔肯雅病毒、皰疹病毒、C型肝炎病毒、寨卡病毒和小核糖核酸病毒等重要病原體，都可以編碼自己的解旋酶（Lehmann et al., 2015b）。儘管這些病毒解旋酶屬於不同的解旋酶家族，並且在病毒的生命周期中發揮著不同而複雜的作用，但它們都有三個共同點：i）解旋酶對於病毒的繁殖必不可少；ii）人們對解旋酶在病毒生命周期中的確切機製作用知之甚少；iii）解旋酶被認為是大分子組件的組成部分。總而言之，我們的結構為nsp13-RTC在SARS-CoV-2複製/轉錄中的作用提供了重要線索，並為測試其他RNA病毒中必需解旋酶的功能提供了指導原則。
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