2020年4月23日訊/
生物谷BIOON/---由新型冠狀病毒SARS-CoV-2（之前稱為2019-nCoV）引起的2019年冠狀病毒病（COVID-19）於2019年12月出現，此後成為全球大流行病。據報導，SARS-CoV-2是β冠狀病毒（betacoronavirus）屬的一個新成員，與嚴重急性呼吸症候群（SARS）冠狀病毒（SARS-CoV）和幾種蝙蝠冠狀病毒密切相關。與SARS-CoV和中東呼吸症候群（MERS）冠狀病毒（MERS-CoV）相比，SARS-CoV-2表現出更快的人際傳播，從而導致世界衛生組織（WHO）宣布為世界性的公共衛生緊急事件。
冠狀病毒使用一種多亞基複製/轉錄複合物。作為病毒多聚蛋白（polyprotein）ORF1a和ORF1ab的裂解產物而產生的一組非結構蛋白（nsp）組裝在一起以促進病毒複製和轉錄。其中的一個關鍵組分---RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp, 也稱為nsp12）---催化病毒RNA合成，因而在SARS-CoV-2的複製和轉錄周期中起著至關重要的作用，它在這個過程中可能需要作為輔因子的nsp7和nsp8的協助。因此，nsp12被認為是瑞德西韋（remdesivir, 也稱為GS-5734）等核苷酸類似物抗病毒抑制劑的主要靶點，其中瑞德西韋已顯示出治療SARS-CoV-2感染的潛力。
為了指導藥物設計，在一項新的研究中，來自中國清華大學、上海科技大學、南開大學、天津大學和中國科學院生物物理研究所的研究人員使用了兩種不同的方案：一種不存在DTT（數據集1），另一種存在DTT（數據集2），並利用低溫電鏡（cryo-EM）技術解析出nsp12與它的輔因子nsp7和nsp8形成複合物時的三維結構。相關研究結果於2020年4月10日在線發表在Science期刊上，論文標題為「Structure of the RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19 virus」。
細菌表達的全長SARS-CoV-2 nsp12（殘基S1-Q932）與nsp7（殘基S1-Q83）和nsp8（殘基A1-Q198）孵育在一起，然後純化出所形成的複合物。在這種複合物的存在下製備出低溫電鏡網格，初步篩選後發現這種網格具有良好的分散性和極佳的顆粒密度。在收集和處理7994個顯微影片後，這些研究人員在2.9埃的解析度下實現對nsp12單體分別與nsp12-nsp8二聚體和 nsp8單體形成的複合物的三維重建，正如之前在SARS-CoV中觀察到的那樣。除了nsp12-nsp7-nsp8複合物，他們還觀察到了對應於nsp12-nsp8二聚體以及單個nsp12單體的單顆粒類型，但這些都沒有給出原子解析度下的三維重建。然而，nsp12-nsp7-nsp8複合物的三維重建提供了完整的結構分析信息。
圖1.SARS-CoV-2病毒nsp12-nsp7-nsp8複合物的三維結構。圖片來自Science, 2020, doi:10.1126/science.abb7498。
SARS-CoV-2 nsp12的結構包含一個「右手」RdRp結構域（殘基S367-F920），以及一個套病毒（nidovirus）獨特性的N端延伸結構域（殘基D60-R249），其中這種延伸結構域採用了套病毒RdRp相關核苷酸轉移酶（nidovirus RdRp-associated nucleotidyltransferase, NiRAN）結構。這種聚合酶結構域（即RdRp結構域）和NiRAN結構域由一個界面結構域（interface domain, 殘基A250-R365）連接(圖1A和圖1B)。在清晰的低溫電鏡圖的指導下構建出的一個額外的N端β髮夾（D29-K50），插入到由RdRp結構域中的掌狀亞結構域和NiRAN結構域夾持的凹槽中（圖2）。這種nsp7-nsp8二聚體顯示出類似於SARS-CoV nsp7-nsp8二聚體的保守結構。相比於nsp7-nsp8二聚體，與nsp12結合的nsp8單體的N端螺旋的定位發生了偏移。在nsp8的N端解析出的13個額外的胺基酸殘基表明它的著名的 「高爾夫球桿（golf club）」形狀的長「軸」是彎曲的。
圖2.N端NiRAN結構域和β髮夾的結構。圖片來自Science, 2020, doi:10.1126/science.abb7498。
SARS-CoV-2 nsp12-nsp7-nsp8複合物的整體結構與SARS-CoV中的相似，1078個Cɑ原子的均方根偏差（root mean square deviation, rmsd）為0.82。然而，有區分這兩者的關鍵特徵。通過低溫電鏡圖，這些研究人員得以構建出SARS-CoV-2 nsp12（包括除S1-D3和G897-D901以外的所有胺基酸殘基）的完整結構。相比之下，SARS-CoV nsp12中的前116個胺基酸殘基沒有被解析出來。在SARS-CoV-2中解析出的NiRAN結構域的部分（殘基4至28和51至249）由8個螺旋組成，在N端有一個五股β摺疊（five-stranded β-sheet）（圖2A）。在SARS-CoV-12病毒結構中，他們另外解析了殘基A4-R118。這些構成了具有5個反平行β鏈和兩個螺旋的結構體。殘基N215-D218在SARS-CoV-2病毒nsp12中形成了一個β鏈，而這些殘基在SARS-CoV nsp12中不那麼有序排列。這個區域與包括殘基V96-A100的連結觸，從而有助於穩定其構象。因此，這四條鏈形成了一個緊湊的半β桶結構。因此，他們將殘基A4-T28和Y69-R249確定為完整的冠狀病毒NiRAN結構域。通過對N末端殘基的解析，他們還能夠確定一個N末端的β髮夾（D29至K50，圖1A和2A）。這個β髮夾插入到由RdRp結構域中的掌狀亞結構域和NiRAN結構域夾持的凹槽中，並形成一組緊密接觸，以穩定整體結構（圖2B）。另一點需要注意的是，他們觀察到C301-C306和C487-C645在沒有DTT的情況下形成二硫鍵。然而，在DTT存在的情況下，螯合鋅離子存在，並且與在SARS-CoV中觀察到的位置相同。
這種聚合酶結構域採用病毒聚合酶家族的保守結構，由三個亞結構域組成：手指亞結構域（殘基L366-A581和K621-G679）、掌狀亞結構域（殘基T582-P620和T680-Q815）和拇指亞結構域（殘基H816-E920）（圖1）。這些催化性的金屬離子在合成RNA的病毒聚合酶的幾個結構中觀察到，不過在引物-模板RNA和核苷酸三磷酸（NTP）不存在的情形下是觀察不到的。
SARS-CoV-2病毒RdRp結構域的活性位點由掌狀亞結構域中保守的聚合酶基序A-G形成，並且它的構型類似於其他的RNA聚合酶（圖1A和3A）。由胺基酸殘基611-TPHLMGWDYPKCDRAM-626組成的基序A包含經典的二價陽離子結合殘基D618，這在大多數病毒聚合酶中是保守的，包括HCV ns5b（殘基D220）和脊髓灰質炎病毒3D
pol（殘基D233）(圖3，B和C)和基序C(殘基753-FSMMILSDDAVVCFN-767)包含在兩個β鏈之間的轉彎處的催化殘基（759-SDD-761）。這些催化殘基在大多數病毒RdRp---比如HCV ns5b中的317-GD-319和脊髓灰質炎病毒3D
pol中的327-GD-329---中也是保守的：第一個殘基是絲氨酸或甘氨酸。
在這種結構中，與其他RNA聚合酶一樣，模板/引物進入通道、NTP進入通道和新生鏈出口通道都帶正電荷，是溶劑可接觸到的，並匯集在一個中央空腔中，在這個中央空腔中，這些RdRp基序介導模板引導的RNA合成（圖3D）。模板/引物進入通道、NTP進入通道和新生鏈出口通道的配置與SARS-CoV中的相類似，也與HCV聚合酶和脊髓灰質炎病毒聚合酶等其他RNA聚合酶相類似（圖3，B和C）。NTP進入通道由一組親水性殘基形成，包括基序F中的K545、R553和R555。據預計RNA模板通過由基序F和G夾持的凹槽進入由基序A和C組成的活性位點。基序E和掌狀亞結構域支持著引物鏈。產物-模板雜交體通過RNA聚合酶前側的RNA出口通道退出這個活性位點。
圖3.RdRp核心區域。圖片來自Science, 2020, doi:10.1126/science.abb7498。
作為2-乙基丁基L-丙氨酸磷醯胺（2-ethylbutyl L-alaninate phosphoramidate）前體藥物的Sp異構體，瑞德西韋（remdesivir, 也稱為GS-5734）已被報導能夠抑制SARS-CoV-2病毒增殖，因此具有臨床潛力。這些研究人員將根據這項研究的結果簡要地討論它的潛在結合和抑制機制。鏈終止核苷酸類似物的療效需要病毒RdRp來識別並成功地將它們的活性形式整合到生長中的RNA鏈上。索非布韋（sofosbuvir），即2'-F-2'-C-甲基尿苷單磷酸酯（2'-F-2'-C-methyluridine monophosphate），是一種靶向HCV ns5b的前體藥物，已被批准用於治療慢性HCV感染。它通過結合HCV ns5b聚合酶的催化位點而發揮作用。
鑑於瑞德西韋和索非布韋都是核苷酸類似物，以及SARS-CoV-2 nsp12和HCV ns5b聚合酶的催化位點在結構上的保守性，他們基於與結合到HCV ns5b上的索非布韋的疊加，對二磷酸瑞德西韋（remdesivir diphosphate）與SARS-CoV-2 nsp12之間的結合進行了建模（圖4A）。總的來說，他們發現SARS-CoV-2 nsp12與ns5b的空載狀態（Apo state）的相似度最高。鑑於ns5b在空載/延伸/抑制狀態下的構象變化，這似乎表明催化殘基D760、D761和典型的D618將發生構象變化，以便與這些二價陽離子形成配位鍵（圖4B）。後者將與基序F中的變構殘基R555一起錨定進入的核苷酸或抑制劑的磷酸基團（圖4C）。在HCV ns5b延伸複合物或它與二磷酸索非布韋（pp-sofosbuvir）形成的複合物的結構中，一個關鍵的特徵是整合到RNA鏈上的二磷酸索非布韋與N291(相當於SARS-CoV-2中的N691)相互作用，但由於它的糖基上發生氟取代，它不能與S282和D225連接成氫鍵網絡（圖4D），不過這是讓進入的天然核苷酸保持穩定所必需的。然而，瑞德西韋保留了一個完整的核糖基團，所以它可能能夠像天然底物一樣利用這個氫鍵網絡。此外，SARS-CoV-2 nsp12中的T680也可能與瑞德西韋的2'羥基形成氫鍵，當然也可能與進入的天然NTP形成氫鍵（圖4D）。此外，基序F中的V557的疏水側鏈很可能讓+1模板RNA鹼基尿苷保持穩定，使得尿苷與進入的三磷酸瑞德西韋（ppp-remdesivir）進行鹼基配對（圖4E）。
圖4.瑞德西韋在SARS-CoV-2病毒nsp12中的摻入模型。圖片來自Science, 2020, doi:10.1126/science.abb7498。
SARS-CoV-2在全球範圍內的迅速傳播突顯了開發新的冠狀病毒疫苗和藥物的必要性。SARS-CoV-2病毒聚合酶nsp12看起來是開發新藥物的一個很好的靶點，特別是考慮到瑞德西韋等先導抑制劑已經以化合物的形式存在。考慮到核苷類似物的結構相似性，這項研究中討論的結合模式和抑制機制也可能適用於其他的此類藥物或候選藥物，包括在
臨床試驗中證明有效的法匹拉韋（Favipiravir）。除了其他的有前景的藥物靶標（比如SARS-CoV-2的主蛋白酶）之外，這個靶點還可以潛在地支持開發抗冠狀病毒混合物，從而潛在地可用於發現廣譜抗病毒藥物。（生物谷 Bioon.com）
參考資料：Yan Gao et al. Structure of the RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19 virus. Science, Published online: 10 Apr 2020, doi:10.1126/science.abb7498.