近日Scripps 研究所的MatthewD. Disney團隊在ACS Central Science發表了題為「Targeting the SARS-CoV‑2 RNA Genome with Small Molecule Binders andRibonuclease Targeting Chimera (RIBOTAC) Degraders」的工作。作者針對2020年世界流行的COVID-19，通過分析其基因組結構特徵，開發了可以通過靶向SARS-CoV-2 RNA基因組影響病毒移碼的小分子化合物；同時以此小分子為基礎發展了核糖核酸酶靶向降解嵌合體，通過細胞核糖核酸酶破壞病毒基因組，證明SARS-CoV-2 RNA基因組也是一類可成藥靶點。
2019 年年底猝不及防的新型冠狀病毒肺炎疫情席捲全球，得益於當前科學技術的發展，科學家迅速進行基因組測序並確定這場疫情是由一類新的冠狀病毒引起。通常，應對病毒的有效策略是發展靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的候選疫苗。然而，疫苗並不能消除SARS-CoV-2，因為並非所有接種人群都是易感人群。此外，該病毒(以及相關冠狀病毒)可在野生動物宿主體內存留，從而構成威脅人畜共患轉移。因此開發可以直接阻斷病毒感染的藥物也尤為重要。與其他RNA病毒一樣，SARS-CoV-2的RNA結構對調節病毒複製、基因表達至關重要。已有的研究結果顯示，SARS-CoV-2的移碼刺激元件（frameshifting element, FSE）在病毒複製周期中起到至關重要的作用。FSE在開放閱讀框ORF1a/ORF1b邊界附近，起到將核糖體閱讀框移碼1個核苷酸的作用（圖1A）。這樣，FSE可以繞過ORF1a末端的終止密碼子，為暴露ORF1b編碼的蛋白如病毒RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）提供機會。對許多病毒來說，移碼元件若發生微小變化都會導致基因組RNA以及感染所需的病毒劑量發生急劇變化。因此，FSE亦成為主要的靶標之一。FSE包括attenuator hairpin (AH), slippery site(SS)和 a three stemmed pseudoknot三個部分，這三者可以暫停核糖體啟動移碼，從而改變編碼蛋白質的mRNA含量。已有研究證明提高FSE的穩定性可以破壞病毒的移碼效率。因此作者基於此設計了兩種不同作用模式的小分子抑制SARS-CoV-2移碼：直接結合併穩定FSE和通過招募內源性核糖核酸酶降解病毒基因組。
圖1.SARS-CoV-2的RNA基因組結構及化合物C1-C5的結構式
在AH結構中，SARS-CoV-2有一個特有的UU loop，因此作者首先採用小分子微陣列篩選方法（AbsorbArray），試圖從3271個可結合RNA的化合物庫中找到選擇性結合此UU loop的化合物。初篩結果得到26個化合物後，又通過競爭性篩選實驗最終得到5個結合活性較強的分子，分別是C1-C5（圖1B）。隨後作者分析了這五個化合物對病毒RNA基因組移碼效率的影響，在轉染有Renilla-firefly 螢光報告系統的HEK293T細胞中，化合物C5能顯著並以濃度依賴的方式降低病毒FSE的移碼效率。同時化合物C5不影響SARS-CoV-2 FSE的RNA水平，也不影響FSE本身的移碼能力。作者還對C5的作用模式及作用靶點進行了研究和驗證，證明其的確是通過結合FSE而發揮效能。
圖2.化合物C5降低SARS-CoV-2 FSE的移碼效率
之後作者嘗試利用化合物合成核糖核酸酶靶向嵌合體（RIBOTAC），通過招募內源性的核糖核酸酶來降解靶標，這種作用模式下，RIBOTAC可以用到催化量，因此既可以增強其活性又能提高選擇性。因此，作者講化合物C5通過聚乙二醇鏈與可以結合核糖核酸酶L的配體相連，得到了C5-RIBOTAC；同時作者也合成了一個不能結合核糖核酸酶L的陰性對照分子C5-C14（圖3A）。RNase L是天然抗病毒免疫反應的一部分，因此，通過RIBOTAC靶向降解可能會刺激局部免疫反應以清除細胞中RNA。文中所有化合物在最高濃度下都不會影響細胞存活，而這些濃度遠高於活性發揮所需的濃度。與化合物C5直接結合不同，C5-RIBOTAC的作用模式不是穩定FSE來抑制病毒移碼，而是通過引起整個SARS-CoV-2病毒的RNA降解而發揮效應。C5-RIBOTAC處理後可劑量依賴性地降低SARS-CoV-2 RNA水平而不影響SARS-CoV的RNA水平（圖4A），進而導致Renilla和firefly兩種螢光素酶表達降低（圖3C,3D）。為了證明是RIBOTAC引起RNA降解是依賴RNA酶L，作者用siRNA敲除核酸酶後，C5-RIBOTAC的活性就會喪失（圖4C，4D）。與此同時，陰性對照分子C5-C14則SARS CoV-2 FSE則不能引起RNA的降解，也明顯喪失破壞病毒移碼的能力。
綜上，作者從SARS-CoV-2的RNA基因組結構出發，使用AbsorbArray方法結合螢光素酶報告系統，篩選並驗證了化合物C5可以選擇性地結合和穩定FSE的AH，並可以降低病毒RNA移碼效率。之後由C5設計開發了可以通過招募核糖核酸酶而選擇性引起SARS-CoV-2RNA降解和病毒活性減弱的RIBOTAC。
圖3. C5-RIBOTAC特異性降解細胞內SARS-CoV-2 FSE
圖4.C5-RIBOTAC降解SARS-CoV-2-FSE RNA
原文連結https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.0c00984
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