分迪點評
這是阿斯利康的科學家發表的第一篇設計PROTACs分子的文章。亮點在於利用EED抑制劑設計的PROTACs不僅降解了EED，還降解了PRC2的複合物的其它亞基EZH2和SUZ12。但具體的降解機制，是因為降解EED導致的其它亞基的調低還是直接標記了PRC2複合物，導致的整體被降解還不確定。但是，降解蛋白複合物的這一理念，為靶向蛋白降解開啟了更大的想像空間，比如，我們降解膜蛋白的細胞內亞基，是否可以同時降解膜蛋白。
此外，今年4月20日阿斯利康的ScottD.Edmondson等人針對PROTAC分子在成藥性方面存在的問題與可能的解決方案發表了看法。
摘要
由核心亞基EZH2、SUZ12和EED組成的PRC2複合物的失控驅動H3K27異常甲基化和許多腫瘤的致癌性。儘管EZH2抑制劑已顯示出很好的臨床活性，但臨床前數據表明，通過EZH2中的二級突變（阻斷藥物與靶點結合）可以獲得耐藥性。為了解決耐藥性問題，課題組設計了幾種異雙功能PROTAC（靶向蛋白降解嵌合體）以有效靶向消除EED。該PROTACs與EED（pKd〜9.0）結合，並促進E3泛素連接酶三元複合物的形成。同時，其能有效抑制PRC2酶的活性（pIC50約8.1），並誘導PRC2複合物中的EED、EZH2和SUZ12迅速降解。此外，PROTACs選擇性抑制PRC2依賴性癌細胞的增殖（半數最大生長抑制[GI50] = 49-58 nM）。總之，課題組的數據表明PROTAC是治療PRC2依賴性癌症的一種新方法。
背景
PRC2是一種表觀遺傳轉錄調節因子，在幹細胞維持、DNA修復以及上皮-間充質轉化等多種生物學過程中發揮作用。EED、SUZ12和EZH2是構成PRC2複合物的核心亞基，通過H3K27的甲基化調節基因表達。EZH2是PRC2的催化亞基，由EED亞基通過兩種機制調節：一種是將PRC2複合物募集到染色質上，另一種是變構活化EZH2甲基轉移酶。
PRC2在疾病中的作用一直是研究熱點。在GCB-DLBCL和濾泡性淋巴瘤中經常發現EZH2的激活突變，支持PRC2在腫瘤發生中的作用。這些激活突變導致H3K27me3增加（H3K27me3抑制關鍵抑癌基因和參與B細胞分化的基因的表達）。EZH2-SAM競爭性抑制劑在B細胞淋巴瘤中具有臨床前和臨床活性，支持了EZH2在腫瘤發生中的關鍵作用。
最近，一種抑制劑PR2複合物的新機制已被報導，該機制使用與EED上變構位點結合的抑制劑，從而阻止了PRC2複合物中組蛋白的募集和EZH2的活化。這些抑制劑在EZH2突變體DLBCL模型中，以及在EZH2抑制劑耐藥性環境中均已顯示出了抗腫瘤活性。考慮到對EZH2小分子抑制劑可能產生的耐藥性，迫切需要針對PRC2複合物活性的新治療方法。
靶向蛋白水解的嵌合體（PROTAC）代表了一種新興的藥理作用模式，與傳統的小分子抑制劑相比具有一定優勢。PROTAC通過一個Linker將兩個小分子連結在一起，其中一個與E3連接酶結合，另一個與目標蛋白結合。以這種方式，PROTACs將靶蛋白募集到E3泛素連接酶附近，以泛素化並最終降解靶蛋白。為了確定PROTACs是否可以作為抑制PRC2活性的替代策略，課題組設計、開發和表徵了以EED為靶標的新型PROTACs，它們可以有效和選擇性地降解PRC2複合物中的EED和相關蛋白。
結果
1、靶向降解EED的PROTACs的設計
課題組試圖通過合成靶向EED亞基的PROTACs（圖1）來抑制PRC2活性。PROTACs是雙功能分子，它包含一個與靶標蛋白（EED）結合的配體，和一個與E3泛素連接酶結合配體，通過Linker共價連接，從而募集E3連接酶以誘導靶標蛋白的泛素化和隨後的降解。在評估了幾種已報導的EED抑制劑後，課題組解析了了EED與其配體複合物的X射線結構，該結構展示了EED抑制劑上適合連接PROTACs的Linker的接頭位置。對於E3連接酶部分，課題組則使用了經過充分研究的Von Hippel-Lindau（VHL）配體，並評估了各種Linker，最終生成了化合物2和3（PROTAC1和PROTAC2）。作為對比，課題組還合成了無活性的PROTACs類似物化合物5和6，以不同的手性消除其對VHL的親和力，同時保持相似的EED結合和理化特性。
圖1、靶向降解EED的PROTACs分子結構
2、PROTACs結合併抑制PRC2複合物
課題組使用表面等離振子共振評估兩個靶向EED的PROTACs（化合物2和3）以及EED抑制劑（化合物4），VHL配體（化合物1）和兩個非活性PROTAC（化合物5和6）與EED的結合。通過結合親和力和生化MTase-Glo試驗（Promega）來測量它們對PRC2催化活性的影響（圖2A和2B）。化合物4與EED結合，其pKD = 9.61±0.11，抑制PRC2功能的pIC50 = 8.43±0.04。
Linker和VHL配體的連接使得化合物2、3、5和6與EED親和力以及對PRC2抑制效力略有降低；然而，所有化合物仍然以低nM效力抑制PRC2催化活性，並以低nM或pM親和力與EED結合。正如預期那樣，VHL配體化合物1不結合EED或抑制PRC2功能。接下來，課題組使用TR-FRET體外三元複合物形成測定法來測量EED：PROTAC：VHL三元複合物形成（圖2C）。三元複合物的形成僅在化合物2和3的存在下發生，化合物2和3具有與VHL結合的正確立體化學結構。課題組觀察到鐘形曲線與先前發表的關於PROTAC誘導的三元複合物形成的觀察結果一致。不出所料，化合物1、4、5和6無法誘導三元複合物的形成（圖2C）。
圖2、PROTACs與EED和VHL形成三元複合物
3、PROTACs促進EED、EZH2和SUZ12的降解
在確定設計的PROTACs可以結合EED和VHL並抑制PRC2酶促活性後，課題組又進行了誘導細胞中EED的降解試驗。如預期，H3K27me3在PROTACs處理後被還原（圖3A）。非活性的PROTACs和EED配體抑制了Lys27處H3的三甲基化，這表明所有的化合物都與EED結合併抑制了PRC2介導的組蛋白3的甲基化（圖3A）。
圖3、PROTACs與EED和VHL形成三元複合物
有趣的是，PROTAC1和PROTAC2處理不僅使EED顯著降低，而且還導致EZH2明顯下降。課題組還證明了無活性的PROTAC或EED配體不會顯著調節EED和EZH2蛋白的表達（圖3A，3B）。為了了解降解的動力學，對PROTAC1和PROTAC2進行了時間歷程實驗。在PROTAC處理的1-2小時內EED蛋白水平下降。EZH2和SUZ12也下降，但動力學略慢（圖3B和3C）。最後，非活性的PROTAC1和PROTAC2在24小時內未導致EED、EZH2或SUZ12蛋白水平下降（圖3B）。
4、PROTAC介導的EED降解是通過泛素-蛋白酶體途徑
為了進一步證實PROTACs通過E3泛素連接酶依賴性機制誘導EED降解，課題組在過量的VHL配體或MLN4924存在下，用PROTAC1和PROTAC2處理細胞，觀察到單獨的過量VHL配體或MLN4924處理不會影響EED或EZH2表達（圖4）。在過量VHL配體或MLN4924存在下用PROTACs進行治療可防止PROTACs介導的EED蛋白水平降低（圖4）。我們發現PROTAC2需要更高含量的VHL配體才能完全抑制EED降解。此外，在經PROTAC處理的細胞中用蛋白酶體抑制劑MG132處理也使得PROTACs介導的EED蛋白降解功能喪失。總之，這些觀察結果表明設計的PROTACs通過泛素-蛋白酶體途徑促進EED的降解。
圖4、PROTACs介導的EED降解是通過泛素-蛋白酶體途徑
5、PROTACs選擇性降解EED、EZH2和SUZ12
為了幫助建立靶向降解EED的PROTACs選擇性曲線，課題組進行了全局蛋白質組學分析，以量化PROTAC1和DMSO處理的細胞中蛋白質的相對豐度的比較。結果發現EED、EZH2和SUZ12是唯一在給藥24小時後顯著降低的蛋白質（圖5）。與預期的一致，EED的豐度下降幅度最大，其次是EZH2和SUZ12。這表明PROTAC1對EED、EZH2和SUZ12具有高度選擇性。
圖5、PROTAC1選擇性降解EED、EZH2和SUZ12
6、PROTACs抑制EZH2突變的Karpas422細胞的增殖
為了評估PROTACs對EZH2突變細胞增殖的影響，用PROTAC1和PROTAC1以及EED抑制劑和VHL配體處理了DLBCL細胞株Karpas422。與僅使用EED抑制劑進行處理相似，PROTAC1和PROTAC2的處理會抑制細胞增殖（圖6A-6D）。VHL配體不影響細胞生長（圖6D）。這些數據表明，對EED的抑制可抑制EZH2依賴性細胞的增殖。
圖6、PROTACs和EED抑制劑均可抑制Karpas422細胞增殖
討論
課題組已經證明了靶向EED的PROTACs可以降解PRC2複合物中的EED及其相關蛋白EZH2和SUZ12。細胞內濃度實驗還表明，PROTACs在細胞核和細胞質部分均存在。兩種PROTACs對EED都具有相當的結合親和力，並在體外與VHL形成三元複合物。免疫共沉澱實驗證實了在PROTACs存在的情況下，EED、EZH2與VHL均形成了三元複合物。在細胞中，兩種PROTACs均可誘導EED迅速降解，而無活性的PROTAC和EED抑制劑則不會。有趣的是，PROTAC2似乎比PROTAC1表現出更快的動力學和更高效的EED降解。總之，這些數據表明，PROTACs的三聯體結構是有效募集VHL / E3和靶向降解EED的關鍵因素。
這些PROTACs比EZH2和SUZ12更快誘導EED降解的現象表明，EED的快速損失使PRC2複合物不穩定。文獻研究表明，PRC2複合物中單個成分的敲除會導致該複合物其它亞基的丟失。與已發表的報告一致，課題組還發現，使用基於CRISPR的技術在Karpas422中敲除EED蛋白會導致EZH2和SUZ12同時下調，與PROTACs介導的EED降解一致。因此，PROTACs誘導的EED降解可能觸發EZH2和SUZ12的後續降解。或者，一旦形成三元複合物，EZH2或SUZ12中暴露的賴氨酸殘基（靠近EED結合位點）可能是PROTACs介導的泛素標記位點。有趣的是，我們觀察到PROTACs處理後1小時內EZH2迅速多聚泛素化。EZH2與靶向降解EED的PROTACs的泛素化機制有待進一步研究。
課題組已經發現PROTAC1和PROTAC2可以有效抑制EZH2突變型DLBCL細胞系以及EZH2 WT橫紋肌樣癌細胞系的增殖（圖6）。PROTACs的抗增殖作用比EED抑制劑低約3-4倍。這表明PROTACs與EED的結合以及隨後對EZH2催化活性的抑制是抗增殖作用的主要驅動力。然而，EED抑制劑和PROTACs洗脫實驗證實與EED抑制劑相比，PROTACs可以提供更長久的抗增殖活性。
之前的文獻報導了EZH2在前列腺癌和乳腺癌中的非催化功能。假設，以EED為目標的PROTACs可能在這種情況下具有活性。但是，該假設基於PROTACs將有效導致所有細胞EZH2的降解。課題組已經在有限數量的EZH2依賴（催化獨立）細胞系中測試了PROTACs的抗增殖作用，但未觀察到生長抑制作用。目前，尚不清楚缺乏生長抑制作用的原因是否是由於對PROTACs介導的降解免疫的EZH2細胞部分所致。有必要進行進一步的研究以深入了解EZH2的非催化功能。
綜上所述，課題組發現了一些靶向降解PRC2複合物的PROTACs。這些分子具有獨特的選擇降解特性，可以作為一種有希望的工具來幫助闡明PRC2複合物的生物學功能。此外，它們可能是治療PRC2依賴性癌症的一種新方法。
DOI：10.1016/j.chembiol.2019.11.004
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