Nature亮點丨抑制劑變「分子膠水」，降解皆有可能

撰文 | Victoria

責編 | 兮

目前藉助泛素連接酶的小分子蛋白降解劑主要分為兩類【1】（詳見BioArt報導：Nature | 第四次製藥業革命-Raymond Deshaies院士獨家綜述多特異性藥物）：一類被稱為「Molecular glue」（分子膠水），一類為「PROTAC」（PROteolysis Targeting Chimeras，蛋白降解靶向嵌合體）。分子膠水指的是一類能夠介導蛋白質-蛋白質相互作用的小分子化合物，當其中一個蛋白質分子為泛素連接酶時，分子膠水可以引起另外一個蛋白質發生泛素修飾，並通過蛋白酶體途徑發生降解。而PROTAC則分別募集靶蛋白和E3泛素連接酶，從而引起靶蛋白的泛素化修飾，導致其進一步被蛋白酶體系統降解。廣義上的分子膠水包括PROTAC。

與傳統意義上的小分子抑制劑不同，分子膠水是一種能夠使傳統藥理學方法難以治療的靶點失活的新策略。之前研究報導中發現的Thalidomide類似物和Aryl sulfonamides等分子膠水降解劑都是利用E3泛素連接酶與靶蛋白之間的互補蛋白-蛋白界面，重編程泛素連接酶的選擇性，以催化劑的方式驅動多輪靶標泛素化。因此，分子膠水也巧妙地避開了傳統抑制劑的局限性，使得一部分靶點從「無成藥性」變為「有成藥性」【2】。雖然分子膠水降解劑非常理想，臨床效果好也很受歡迎，但迄今為止發現的分子膠水降解劑仍寥寥可數，其發現過程具有與很大的偶然性，缺乏一個系統的發現和設計策略。

2020年6月3日，Dana-Farber Cancer Institute的Benjamin L. Ebert團隊與Friedrich Miescher Institute的Nicolas H. Thomä團隊合作在Nature雜誌上發表題為The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K的研究論文。早在2014年，Benjamin L. Ebert團隊與諾獎得主William G. Kaellin Jr.團隊背靠背在Science雜誌上發表了2篇文章，報導了第一個發揮蛋白質降解作用的分子膠水lenalidomide（Thalidomide類似物），利用CUL4/CRBN降解IKZF1/3。2015年，Benjamin L. Ebert團隊在Nature雜誌上發表文章，報導了lenalidomide分子膠水的第二個底物CK1α。

在最近的這篇文章中，作者通過系統地挖掘資料庫及CRISPR-Cas9篩選，發現細胞周期蛋白依賴激酶CDK抑制劑CR8是一種新的分子膠水降解劑。與CDK結合的CR8誘導CDK12/cyclin K與CUL4/DDB1直接形成複合物，從而繞過對底物受體DCAFs的要求，使cyclin K發生泛素化並通過蛋白酶體系統降解。進一步通過對蛋白-小分子-蛋白複合物的結構進行解析和對小分子化合物的結構改性，作者發現在對小分子抑制劑的表面暴露部分進行結構改性時，可以使其產生功能獲得性（gain-of-function）的膠水特性。這一策略具有廣泛適用性，借鑑這個策略可將很多與蛋白質結合的小分子轉化為分子膠水。

為了篩選能夠通過E3泛素連接酶介導蛋白降解的小分子，作者將4518個臨床和臨床前小分子的藥物敏感性與578種腫瘤細胞系中的499個E3連接酶組分的mRNA水平進行關聯分析。其中，發現了DCAF15的mRNA水平與indisulam和tasisulam的細胞毒性相關聯，與此前Science文章的報導相一致【3】。令人振奮的是，作者篩選發現了一個新的分子膠水——CDK抑制劑(R)-CR8。CR8的細胞毒性與CUL4銜接蛋白DDB1的mRNA水平之間具有相關性。最重要的是，全蛋白質組定量質譜顯示cyclin K是CR8處理後唯一一個豐度持續降低的蛋白質。作者通過CRISPR-Cas9篩選驗證了CUL4/DDB1參與了CR8介導的cyclin K降解。此外，作者還鑑定了 CDK12（CR8的一個已知靶點，其活性依賴於與 cyclin K的相互作用）是CR8誘導的細胞周期蛋白cyclin KeGFP失穩的關鍵分子（圖1）。

圖1. CR8誘導的cyclin K降解取決於DDB1和CDK12

此前發現的分子膠水，如Thalidomide和Aryl sulfonamides，在作用過程中，分別依賴於CUL4泛素連接酶複合物的底物受體CRBN和DCAF15。那麼CR8是否也依賴於某一個DCAF呢？為此，作者利用重組純化蛋白進行了體外實驗，數據表明，CR8通過DDB1直接與CDK12-cyclin K結合，進入CUL4-RBX1-DDB1連接酶核心，驅動CR8誘導的cyclin K降解，該過程不需要任何DCAF底物受體。通過對CUL4-RBX1-DDB1-CR8-CDK12-cyclin 複合物的結構進行解析，並與CUL4-RBX1-DDB1-CRBN-Lenalidomide-CK1a複合物的結構進行對比分析，這種發現CDK12扮演了類似於CRBN底物受體的角色，而cyclin K則與E2相鄰近，接收泛素修飾。進一步結構和生化分析表明，CR8誘導CDK12或CDK13與DDB1發生特異性的蛋白-蛋白相互作用，而CDK的C-端延伸在該結合過程中發揮重要作用（圖2）。

圖2. CR8結合的CDK12以類似DCAF的方式結合DDB1

CDK12表面2-吡啶部分的存在和正確的取向，使CR8的功能獲得性增加，導致cyclin K的降解。DDB1與不同的抑制劑之間的相互作用顯示出相當大的可塑性，CR8、DRF053、roscovitine和flavopiridol結構上不同的部分也可以促進CDK12-cyclin K的募集。CR8-苯基吡啶賦予了它分子膠水的活性。最後作者對比了CRL-4街道的cyclin K降解與非降解性CDK抑制劑對CR8的細胞毒性影響，發現cyclin K降解會增加CR8的毒性（圖3）。

圖3. CR8的2-吡啶部分賦予分子膠水降解活性

長期以來，研究者都在懷疑激酶抑制劑在其作用模式中可能含有降解的效能【4】，這項研究提供了一個激酶抑制劑骨架如何獲得降解特性的結構和特性剖析。迄今為止，分子膠水降解劑僅被證明與E3連接酶結合募集底物。CDK12並不是E3連接酶的組分，但在這個過程中充當了類似底物受體的作用，將DDB1連接到底物靶標cyclin K。因此，CR8繞過了對DCAF的要求。儘管cyclin K是主要的泛素化靶點，但是CDK12在長期暴露於CR8後可能會發生自泛素化，其方式與經典的DCAFs相似【5】。

激酶抑制劑的選擇性通常都不理想，小分子誘導的利用互補蛋白-蛋白界面的激酶失活模型為提高藥物選擇性提供了嶄新的思路。通過對CR8結構進行改性，作者發現CR8分子膠水的活性很大程度上依賴於暴露在激酶表面的2-吡啶部分。暴露在蛋白質表面的單個殘基的突變能夠顯著促進蛋白質高級結構複合物的形成，因此，旨在增加表面疏水性的單殘基突變有助於產生有序的蛋白質組合。通過結合小分子化合物(如酶抑制劑CR8)原則上也可模擬由胺基酸突變引起的蛋白質表面性能的改變，從而對蛋白質-蛋白質互作產生強烈影響，這表明化合物誘導的蛋白質-蛋白質相互作用可能比我們先前所公認的更為普遍。這項研究結果提示，修飾結合靶標的小分子的表面暴露區域是一種合理的策略，可用於開發特定蛋白質靶標的分子膠水降解劑。

原文連結：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2374-x

製版人：小嫻子

參考文獻

1. Deshaies, R.J. Multispecific drugs herald a new era of biopharmaceutical innovation.Nature 580, 329–338 (2020).

2. Bondeson DP, Mares A, Smith IE, et al. Catalytic in vivo protein knockdown by small-molecule PROTACs. Nat Chem Biol. 2015;11(8):611‐617.

3. Han T, Goralski M, Gaskill N, et al. Anticancer sulfonamides target splicing by inducing RBM39 degradation via recruitment to DCAF15. Science. 2017; 356(6336): eaal3755.

4. Schreiber SL. A Chemical Biology View of Bioactive Small Molecules and a Binder-Based Approach to Connect Biology to Precision Medicines. Isr J Chem. 2019;59(1-2):52‐59.

5. Fischer ES, Scrima A, Böhm K, et al. The molecular basis of CRL4DDB2/CSA ubiquitin ligase architecture, targeting, and activation. Cell. 2011;147(5):1024‐1039.