齊湘兵/韓霆合作報導分子膠水家族新成員

撰文 | Victoria

責編 | 兮

分子膠水（Molecular glue）指的是一類能夠介導蛋白質-蛋白質相互作用的小分子化合物。實際上，狹義的分子膠水指的是分子膠水降解劑（Molecular glue degrader），它們介導的是泛素蛋白酶體系統（UPS）組分（以前主要是E3泛素連接酶，現在也包括除E3以外的其他UPS組分）與目標蛋白的相互作用，而後兩者結合的結果是促進目標蛋白的泛素化修飾並進一步被降解。與PROTAC（proteolysis targeting chimera，蛋白降解靶向嵌合體）常見的三結構域（底物結合區，E3連接酶結合區以及linker區）特點不同，分子膠水通常更小，而且其發現具有明顯的偶然性。現在僅發現了為數不多的分子膠水，包括沙利度胺（Thalidomide）及其類似物【1, 2】，芳基磺醯胺類（Aryl sulfonamides）【3】和CR8等【4】。

分子膠水本身不但可以直接用作藥物靶向對應的目標蛋白，而且基於這些分子膠水及其衍生物可以設計各種不同的PROTAC，是PROTAC研究和藥物開發的工具基礎，自然而然，對分子膠水本身的系統性篩選具有重大意義。

最近，來自NIBS和清華大學生物醫學交叉研究院的齊湘兵團隊與韓霆團隊在eLife雜誌上發表題為Discovery of a molecular glue promoting CDK12-DDB1 interaction to trigger Cyclin K degradation的研究論文。早在2017年，韓霆博士作為第一作者，在Science雜誌上發表了關於靶向DCAF15的分子膠水sulfonamides的文章，成為第二個被發現的分子膠水【3】。值得注意的是，前不久，Benjamin L. Ebert團隊與Nicolas H. Thomä團隊合作在Nature雜誌上發表題為The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K的研究論文【4】（詳見BioArt報導：Nature亮點丨抑制劑變「分子膠水」，降解皆有可能），Benjamin L. Ebert團隊也是發現第一個分子膠水沙利度胺（Thalidomide）的團隊之一【1, 2】。

在本文中，作者使用NRF2活性為標準，進行高通量的藥物篩選，發現HQ461具有抑制A549細胞活性的能力。而進一步基於CRISPR-Cas9基因敲除的篩選，發現E2和CRL4 E3連接酶對HQ461細胞毒性的關鍵作用。敲除這些基因後，HQ461的細胞毒性顯著降低，同時HQ461的作用依賴於CRL4 E3連接酶，可能是一個分子膠水（圖1）。

圖1、HQ461是一個分子膠水，或通過CUL4 E3連接酶發揮作用

分子膠水一方面結合E3連接酶（或者其他UPS組分），另外一方面結合被降解的底物蛋白，那麼下一步就是尋找HQ461的底物蛋白。作者通過功能獲得性（gain-of-function）遺傳篩選方法，在HCT116細胞中篩選能夠引起HQ461藥物抵抗的突變，發現其中最顯著的突變發生在CDK12基因上，即CDK12 G731E和G731R。為了進一步確定CDK12 G731E和G731R的作用，作者在A549細胞中構建了CDK12 G731E和G731R突變敲入的細胞系，發現突變細胞變得對HQ461不敏感了（圖2）。

圖2、CDK12突變引起HQ461藥物抵抗，提示HQ461通過CDK12發揮作用

那麼CDK12就是HQ461分子膠水的底物蛋白嗎？答案是否定的。儘管HQ461處理引起CDK12大約50%的蛋白水平降低，但是當使用CRISPR敲除CDK12蛋白本身並不能引起細胞死亡，說明CDK12蛋白降低並不水HQ461細胞毒性的原因。

那麼底物是誰呢？CDK12本身是一個蛋白激酶，與其他細胞周期相關的CDK類似，CDK12通常與cyclin蛋白形成蛋白複合體，而且cyclin蛋白通常都不穩定，而CDK蛋白則通常較穩定。與CDK12結合的是cyclin K，誠然，cyclin K成為下一步研究的重點對象。幸運的是，作者發現，HQ461處理引起cyclin K顯著降低，而CDK12突變後，HQ461不能再引起cyclin K蛋白降低。通過一系列抑制劑及過表達實驗，作者最終確定了cyclin K就是HQ4611分子膠水的底物蛋白。

那麼問題來了，以前的分子膠水沙利度胺和磺醯胺都是一邊結合E3泛素連接酶，一邊結合底物。而HQ461結合的並不是底物cyclin K，而是CDK12，提示它的分子-分子相互作用可能與以前的分子膠水不同。那麼CDK12在其中發揮什麼樣的作用呢？

沙利度胺結合的是CUL4家族的CRBN E3連接酶；磺醯胺結合的是CUL4家族的DCAF15 E3連接酶，HQ461同樣是通過CUL4家族蛋白發揮作用，但是還不清楚具體的E3連接酶是什麼。而且在gain-of-function遺傳篩選中，並未發現任何一個可能的DCAF E3連接酶在HQ461的細胞毒性中發揮作用。

通過體外實驗，作者最終發現，HQ461直接介導DDB1與CDK12/cyclin K複合體的結合，不需要任何其它的DCAF E3連接酶，也就是說，在HQ461的案例中，這個分子膠水不需要實際上的E3泛素連接酶，而是通過CUL4泛素連接酶複合物的骨架，介導泛素分子直接從E2向底物蛋白cyclin K發生轉移，進而引起cyclin K的多泛素化和降解（圖3）。

圖3、HQ461分子膠水介導DDB1與CDK12結合

本研究與前文提到的分子膠水文章【4】（詳見BioArt報導：Nature亮點丨抑制劑變「分子膠水」，降解皆有可能）一起，提示分子膠水可能並不一定與底物直接結合，可能存在一個中間蛋白（如CDK12），而分子膠水引起的泛素從E2向底物蛋白的轉移很大程度上依賴於兩者的空間位置。分子膠水工具包正在不斷擴展，類似於HQ461和CR8這樣的分子膠水並不依賴於具體的DCAF E3連接酶，在利用它們設計PROTAC時，也就不需要考慮靶組織/細胞是否表達具體的DCAF，具有更寬的適用範圍，期待藥物化學家們能夠利用這些新的分子膠水設計更多新型的PROTAC分子。

原文連結

https://elifesciences.org/articles/59994

製版人：琪醬

參考文獻

1.Krönke J, Udeshi ND, Narla A, et al. Lenalidomidecauses selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myelomacells. Science. 2014;343(6168):301-305. doi:10.1126/science.1244851

2. Lu G, Middleton RE, Sun H, et al. The myeloma druglenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikarosproteins. Science. 2014;343(6168):305-309.doi:10.1126/science.1244917

3.Han T, Goralski M, Gaskill N, et al. Anticancersulfonamides target splicing by inducing RBM39 degradation via recruitment toDCAF15. Science. 2017; 356(6336): eaal3755.

4.Słabicki, M., Kozicka, Z., Petzold, G. et al. TheCDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K. Nature(2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2374-x