Nature亮點 | 蛋白靶向降解技術群雄四起，LYTAC或成魅力新秀

2020-07-31 BioArt

撰文 | Victoria

責編 | 兮


靶向誘導蛋白降解技術(Proteolysis targeting chimeras, PROTAC)成為繼小分子抑制劑（SMI）和單克隆抗體（mAb）藥物後的又一大熱門。與SMI和mAb相比，PROTAC具有獨到的優勢，能夠靶向眾多的以前被稱為「不可成藥」的蛋白分子。迄今已有上百種PROTAC分子已經或者正在研製當中，眾多的新興創業公司也是群雄崛起，包括國外的Arvinas（以Craig Crew為代表，其代表作為第一個進入臨床試驗的PROTAC分子ARV-110），C4（以Nathanael Gray和James Bradner為代表），Kymera，Vividion，Cedilla （創始人包括諾獎得主William Kaelin等），Oncopia（王少萌為代表），Cullgen（金堅為代表），而多家大藥企也在跑馬圈地，如諾華（James Bradner領導）、安進（Raymond Deshaies領導，詳見BioArt報導：Nature | 第四次製藥業革命-Raymond Deshaies院士獨家綜述多特異性藥物）等。另外，國內也成立了多家以PROTAC為基礎的初創企業，如凌科藥業、分迪科技、開拓藥業等。

雖然相對於SMI和mAb藥物，PROTAC具有獨特的優勢，但是也存在明顯的短板。比如，PROTAC的靶點通常是胞內蛋白，而對分泌蛋白和細胞膜蛋白則束手無策。細胞膜蛋白的降解通常是通過溶酶體途經完成，如EGF引起的EGFR降解過程。因此，溶酶體降解途徑也成為靶向降解膜蛋白的主要設計思路。

2020年7月29日，史丹福大學HHMI研究員Carolyn R. Bertozzi教授在Nature雜誌上發表了題為Lysosome-targeting chimaeras for degradation of extracellular proteins的文章，在文中，作者設計並驗證了使用溶酶體降解途經降解胞外蛋白和細胞膜蛋白的LYTAC技術，並以EGFR，PD-L1和CD71等為例證明了LYTAC技術的可行性和特異性。該研究成為PROTAC的外延，豐富了蛋白降解途經成藥的工具箱。

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細胞表面的溶酶體靶向受體（lysosome-targeting receptors，LTRs）介導蛋白質向溶酶體的轉運及後續的降解過程【1】。陽離子-非依賴甘露糖-6-磷酸受體（cation-independent mannose-6-phosphate receptor，CI-M6PR，又稱IGF2R）是LTR的典型代表，能夠將含有甘露糖-6-磷酸（mannose 6-phosphate，M6P）支鏈的N糖原修飾的蛋白質轉運到溶酶體進行降解【2】。當CI-M6PR結合待降解的蛋白並進入溶酶體以後，溶酶體內的低PH值條件引起二者解離，蛋白底物則被溶酶體所降解，而CI-M6PR本身通過高爾基體再次轉運到細胞膜循環利用【3】。

以此為基礎，作者設計了LYTAC系統，對分泌蛋白和細胞膜外蛋白進行靶向降解。LYTAC系統包括2個主要部分，一部分是能與LTR結合的含M6P支鏈的NCA聚糖肽（n=20~90），另一部分則是與待降解的底物蛋白對應的特異性抗體（圖1）。因此，作者也從這兩部分對LYTAC系統進行分別的設計和優化。

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圖1. LYTAC系統圖示


首先，作者在NCA聚糖肽上連接螢光分子NA-647，檢測並優化聚糖肽是否能夠將貨物帶到溶酶體中，發現與陰性對照支鏈GalNAc和mannose相比，M6P和M6Pn能夠有效地將貨物帶入細胞內，並定位於溶酶體（圖1）。

然後，作者通過CRISPRi篩選，確定LYTACs作用機制依賴於IGF2R、內涵體（endosome）、囊泡轉運（vesicle trafficking）、內涵體-溶酶體融合以及網格蛋白（Clathrin）依賴的內吞途經等相關信號通路。此外，作者還發現胞吐體（exocyst）也至關重要，推測其參與CI-M6PR向細胞膜的呈遞。使用CRISPR敲除IGFR2，EXOC1和EXOC2均能顯著降低細胞表面的CI-M6PR的表達水平（圖2）。

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圖2. CRISPRi篩選識別LYTACs的關鍵細胞機制


據此，作者進一步在poly(M6Pn)上共價偶聯抗體，合成了第一個帶正電的抗體-LYTAC分子——Ab-1（其中的抗體部分為抗小鼠IgG，相當於WB中的二抗，這樣就可以配合各種一抗，降解對的蛋白底物）。首先，作者嘗試了mCherry蛋白和與之對應的小鼠抗mCherry抗體，發現Ab-1能夠有效地將mCherry蛋白和小鼠抗mCherry抗體一起轉運到細胞內。進一步作者嘗試了一個臨床前研究的ApoE4抗體，發現Ab-1同樣可以將其轉運進細胞，以此證明了LYTAC方法應用於分泌蛋白的普遍適用性。

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圖3. LYTACs將可溶性蛋白質靶向溶酶體進行降解


以上實驗證明，LYTAC可以靶向遞送分泌的蛋白進入細胞（以外源性抗體為例）（圖3），那麼LYTAC是否也能如願地降解細胞膜蛋白呢？作者進一步選用EGFR、PD-L1和CD71為例，證明了LYTAC的可行性和有效性。以臨床應用的EGFR單克隆抗體cetuximab為基礎，作者合成了第二個LYTAC分子——Ab-2，並發現Ab-2能夠有效地降解EGFR分子，而該過程依賴於IGFR2，且能夠被高濃度的M6P競爭性抑制，也可以被溶酶體抑制劑氯喹所阻斷。更重要的是，通過蛋白組學檢測，作者發現，Ab-2具有極強的特異性，僅降解EGFR蛋白，而不存在脫靶效應。以抗PD-L1抗體和另一個PD-L1抗體atezolizumab為基礎，作者分別合成了第三個LYTAC分子——Ab-3和Atz-M6Pn，發現這兩個LYTAC均能降解PD-L1分子。

至此，作者證明了LYTAC技術的可行性、有效性、特異性及普適性，為靶向蛋白降解成藥打開了一個全新的領域。作為一個原型，文章中的LYTAC分子還存在很多局限性，需要更多的藥物學家進一步優化，使之能夠成為臨床上切實可行的治療方案。最後值得一提的是，就在2020年6月9日，以LYTAC為基礎的初創公司Lycia Therapeutics獲得了5000萬美元的融資，開展LYTAC相關的first-in-class產品管線，期待看到更多的產品進入市場！


原文連結：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2545-9


製版人：毯毯


參考文獻

1. Coutinho, M. F., Prata, M. J. & Alves, S. A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway. Mol. Genet. Metab. 107, 257–266 (2012)；

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3. Gary-Bobo, M., Nirdé, P., Jeanjean, A., Morère, A. & Garcia, M. Mannose 6-phosphate receptor targeting and its applications in human diseases. Curr. Med. Chem. 14, 2945–2953 (2007)

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