藥學院饒燏課題組成功利用PROTAC技術降解多種突變型BTK蛋白

藥學院饒燏課題組成功利用PROTAC技術降解多種突變型BTK蛋白

克服對臨床一線藥物依魯替尼耐藥的非霍奇金淋巴瘤

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清華新聞網3月27日電 抗癌藥物耐藥無疑是相關患者最痛苦的事。全球銷售額排名前20的依魯替尼是近年來治療淋巴瘤和慢性淋巴細胞性白血病的明星分子，即使是這樣療效顯著的靶向藥也難以避免耐藥的發生。3月19日，清華大學藥學院饒燏課題組與生科院劉萬裡課題組，以及北京大學腫瘤醫院朱軍課題組合作在血液學國際著名期刊《白血病》（Leukemia）在線發表了最新研究成果《利用PROTAC技術降解多種突變型BTK蛋白克服依魯替尼耐藥的非霍奇金淋巴瘤的潛在治療方案》（Degradation of Bruton’s tyrosine kinase mutants by PROTACs for potential treatment of Ibrutinib -resistant Non-Hodgkin lymphomas）。該論文通過構建新型高溶解度的BTK蛋白高效降解劑，成功高效的降解多種臨床相關的突變型BTK蛋白，克服了臨床上非霍奇金淋巴瘤由於BTK蛋白突變引起的對臨床一線藥物依魯替尼的耐藥性。更為重要的是，新策略克服腫瘤耐藥的有效性得到了體內實驗的驗證。

布魯頓酪氨酸蛋白激酶（Bruton's tyrosine kinase，BTK）屬於非受體型酪氨酸蛋白激酶，在B淋巴細胞信號通路（BCR）上遊部分發揮著重要作用。作為Tec激酶家族的一員，BTK在B淋巴細胞分化和發育中起到關鍵作用。除了T淋巴細胞和自然殺傷細胞，BTK只在造血細胞中有表達。在生物體中，BTK蛋白發揮了非常重要的生理功能。1952年美國兒科專家Ogdon Bruton發現如果在兒童體內缺乏某種抗體，就會導致X-相關血中丙球蛋白貧乏症（XLA），導致復發性的細菌感染和敗血症。1993年，導致X-相關血中丙球蛋白貧乏症的基因被最終確認，在人體中，如果基因組中缺乏BTK基因，會導致B細胞數明顯下降，並且伴有血清丙種蛋白水平下降。

在活化的外周血B細胞樣（activated B-cell-like，ABC樣）瀰漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）中，BTK在這類細胞的免疫逃逸中發揮著重要作用。BTK蛋白是首例在發現的在細胞凋亡方面具有雙功能條件作用的TEC家族激酶，在B淋巴細胞中能夠促進自由基引發的細胞凋亡，但是卻能夠抑制Fas活化的細胞凋亡。在BCR的通路上，BTK蛋白是受酪氨酸蛋白激酶LYN和脾酪氨酸激酶SYK激活的，當BTK蛋白活化後，即可激活下遊蛋白PLC-γ2，然後促進內源性鈣離子、甘油二酯（DAG）、三磷酸肌醇（IP3）的釋放，最終激活細胞核因子（NF-κB）的活化，從而抑制B淋巴細胞的凋亡，並且促進癌症的發生。

非霍奇金淋巴瘤（NHL）是B細胞惡性腫瘤的一種，僅美國每年新增病例6萬餘人。彌散性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）是NHL中最常見的一種，在美國和英國每年的發病率高達0.08%。套細胞淋巴瘤（MCL）作為NHL的一種，5年生存率小於50%。BTK共價抑制劑依魯替尼一直是治療多種非霍奇金淋巴瘤的一線用藥，包括套細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、華氏巨球蛋白血症。2018年，依魯替尼的全球銷售額是44.5億美元，比2017年增長39.4%。儘管如此，根據最新的臨床數據報導，針對依魯替尼已經出現了嚴重的耐藥性。由於BTK蛋白481位半胱氨酸突變為絲氨酸（C481S），使得依魯替尼的活性下降近500倍，臨床數據已經證明這一突變是病人產生對依魯替尼耐藥的根本原因。並且證明，BTK蛋白481位其他突變也會引起依魯替尼失效。 

圖1：降解依魯替尼耐藥的C481突變BTK示意圖。A L18I降解C481突變BTK的機制；B 野生型及表達C481T (C/S)突變型BTK蛋白的Hela細胞，L18I處理4天後BTK蛋白量隨藥物濃度的變化曲線；C 表達C481G (W/A)突變型BTK蛋白的Hela細胞，L18I處理4天後BTK蛋白量隨藥物濃度的變化曲線；D BTK降解劑的設計示意圖E BTK C481S 突變的HBL-1細胞系，L18I處理36h後細胞中pPLCγ-2, PLCγ-2, p-ERK1/2, ERK1/2, p-p38, p38, 以及β-actin蛋白含量隨藥物濃度的變化曲線。

饒燏課題組通過構建全新骨架的PROTAC小分子，招募E3泛素化連接酶靶向降解BTK蛋白。新構建的BTK蛋白降解劑可以在轉染的HeLa細胞中以小於50 nM的藥物濃度高效降解多種突變類型（C481S/T/A/G/W）的BTK蛋白。更為重要的是，新策略可以引起突變型DLBCL腫瘤內BTK蛋白水平的降低，從而在體內有效抑制腫瘤的生長，克服腫瘤BTK激酶由於C481位點突變引起的對臨床一線藥物依魯替尼的耐藥性。除此之外，本研究還針對BTK蛋白下遊信號進行了探索，如PLC-γ2、p38及ERK1/2，明確了新型PROTAC分子作用於BTK蛋白後引起的細胞下遊信號的改變，從機制層面上闡述了新策略發揮抗腫瘤效果的原因。

除治療DLBCL外，新型PROTAC小分子也可以有效抑制MCL（mino及Z138），其效果優於目前臨床一線藥物依魯替尼。本研究的另一大亮點是將PROTAC策略與傳統小分子抑制劑聯用，如copanlisib、dasatinib等，大大提高了PROTAC策略的抗腫瘤效果。 

圖2：L18I藥效學研究；A  L18I和依魯替尼對BTK C481S突變型HBL-1細胞的生長抑制活性；B L18I和依魯替尼對BTK C481S突變過表達型MCL (Mino or Z138)細胞的生長抑制活性；C 與依魯替尼相比，L18I在BTK C481S突變的小鼠腫瘤（HBL-1）模型中顯著抑制腫瘤的生長並對小鼠體重無明顯影響；D L18I處理後，小鼠腫瘤組織 C481S突變的BTK蛋白水平。

該工作為基於PROTAC進行抗耐藥非霍奇金淋巴瘤的藥物研發提供了重要信息，目前該團隊研究人員在進一步進行此類新型化合物的開發工作，希望繼續提高其代謝穩定性及抗腫瘤效果。

饒燏課題組致力於探究細胞內靶向蛋白質降解技術（proteolysis-targeting chimeras，PROTAC），以及將PROTAC技術轉化為臨床相關的抗腫瘤活性分子，並於近年來陸續在《細胞研究》《化學通訊》《蛋白質和細胞》《細胞發現》《白血病》等重要期刊中。

 清華大學饒燏教授、劉萬裡教授和北京大學腫瘤醫院朱軍教授為本論文共同通訊作者。饒燏課題組博士生孫永匯、北京大學腫瘤醫院副研究員丁寧以及北京大學腫瘤醫院研究員宋玉琴為本文並列第一作者。該研究得到了國家自然科學基金以及國家重大新藥創製項目的資助，同時也得到了北京自然科學基金的大力支持。

原文連結：

https://www.nature.com/articles/s41375-019-0440-x

供稿：藥學院

編輯：李華山

審核：周襄楠