背景
熱休克蛋白90（Hsp90）是一種眾所周知的依賴ATP的蛋白，可實現細胞在體內的平衡，Hsp90蛋白在癌細胞的生長和增殖中起著重要作用。此外，激酶水平還與Hsp90分子伴侶周期高度相關，這使Hsp90成為了抗癌治療的靶標。但是，在Hsp90分子伴侶周期中，Hsp90抑制劑會與ATP口袋結合，最終阻止了ATP的水解，不可避免地損害了所有Hsp90。因此，現階段研究表明單純的抑制Hsp90或直接靶向Hsp90 ATPase結合位點可能不是實現癌症治療的最佳選擇。因此，我們必須找到新的策略或找到以前未知的結合位點從而實現抗癌效果。伴侶蛋白Cdc37負責將激酶募集到Hsp90，是Hsp90伴侶蛋白系統的一種靶向激酶的特定亞基，在結合開放狀態的Hsp90之前，Cdc37可選擇性地識別並結合未摺疊的激酶蛋白。迄今為止，已經報導了Hsp90-Cdc37的兩個晶體結構，但是精確的識別相互作用和潛在的小分子結合位點我們仍然不清楚。因此尋找與Hsp90-Cdc37的關鍵殘基相互作用的特定小分子具有重要的意義。通過識別關鍵殘基並選擇性破壞Hsp90和Cdc37之間的相互作用可以精確阻斷激酶客戶的摺疊，從而達到抗癌治療的作用。到目前為止，還沒有小分子與Hsp90或Cdc37特異性結合的報導，Science Advances雜誌在線發表了中國藥科大學尤啟冬教授和上海交通大學張健教授課題組合作研發的Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制劑DDO-5936，該工作首次闡明Hsp90-Cdc37及特異性的小分子抑制劑的結構。通過對Hsp90-Cdc37結合界面有重大貢獻的殘基進行分子動力學（MD）模擬，並通過誘變進一步鑑定數據。結果表明，Hsp90上的E47和Q133與Cdc37上的R167之間相互作用，是Hsp90-Cdc37 PPI結合的決定因素。總而言之，這些結果表明DDO-5936的發現可能已經確定了Hsp90 N末端先前未知的結合位點，從而破壞了它與Cdc37的相互作用，通過對Hsp90及其伴侶分子周期的調控和對Hsp90-Cdc37的功能深刻的了解，Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用可能成為一種新型且有效的癌症治療靶標。
圖1.DDO-5936與Hsp90-Cdc37的相互作用機制
圖片來自ScienceAdvances
分子動力學模擬蛋白-蛋白相互作用
本研究首先通過長程的分子動力學模擬蛋白-蛋白相互作用過程中的動態變化，Hsp90-Cdc37複合物的結構均從蛋白質資料庫（PDB）獲得。從PDB獲得了兩種已知的複合物（PDB ID：1US7和2K5B），用於進一步分析。首先去除結晶水分子並使用TIP3P水分子將複合物溶劑化，將抗衡離子添加到了溶劑中。在執行MD之前，將整個系統分兩步進行最小化。然後，將整個系統從0加熱到300 K，最後，在恆定壓力下使用50 ns的生產動態進行進一步分析，並以20 ps的間隔保存。接著計算Hsp90-Cdc37動態結合過程中的結合自由能並進一步分析單個胺基酸結合位點對其影響，得到了動態結合面中不同的胺基酸殘基對結合貢獻的大小。並在此結果的基礎上，並通過對關鍵結合位點上突變蛋白的測試，驗證了結合面上起到關鍵作用的胺基酸殘基，並首次證明了Hsp90蛋白中的Glu47、Gln133與Cdc37蛋白中的Arg167形成的氫鍵作用網是Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用的關鍵，其中任一胺基酸的突變會造成全部親和力的喪失。因此，研究此關鍵相互作用所在的結合區域成為了抑制劑設計的重要基礎。
圖2. DDO-5936與Hsp90-Cdc37 PPI界面上的關鍵殘基結合
圖片來自ScienceAdvances
圖3. 關鍵胺基酸的突變對親和力影響
圖片來自ScienceAdvance
在深入地研究了Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用表面的識別機制後，尤啟冬教授等人基於前期實驗結果，進一步開展了對抑制劑設計策略的篩選。從1500,000化合物商業庫中篩選包含正電或鹼性基團的化合物，過濾得到含有120,537個化合物的靶向庫，然後通過分子對接特異性篩選可以靶向於關鍵相互作用網絡的小分子，隨後篩選其結合模式並計算其結合自由能，結合結構多樣性，根據Hsp90-Cdc37複合物的晶體結構（PDB ID：2K5B和1US7），我們使用Hsp90上的關鍵殘基（包括E47和Q133）來預測潛在的結合位點。然後，通過級聯對接進行配體對接，包括標準精度對接，超精度對接和MM / GBSA評分。最終選擇33個化合物進行測試，最後通過體外高通量篩選得到了先導化合物compound 11（21.1μM）。通過進一步的結構優化，得到了親和力更高、結合模式明確、細胞內有效的Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用調控劑DDO-5936，其體外親和力達到低微摩爾級別。整個篩選流程如下：
圖4.通過篩選得到Ddo-5936抑制劑
圖片來自ScienceAdvances
機制研究
細胞內作用機制研究結果表明，DDO-5936阻斷Hsp90-Cdc37相互作用後對激酶類蛋白的直接降解影響較小，影響較大的是阻滯其磷酸化的成熟過程，從而達到抗腫瘤細胞增殖的效果。進一步研究發現，DDO-5936具有較高的靶標特異性，顯著抑制細胞周期，並在體內藥效學研究中表現出了初步的有效性。
總結
絕大多數的蛋白酶需要Cdc37蛋白的協助完成Hsp伴侶循環最終實現成熟與釋放，不同於以往與Hsp形成競爭關係的抑制劑，阻斷Hsp與Cdc37的相互作用也是一種好的辦法，這樣不僅可以替換那些有毒副作用的抑制劑藥物，也可以很好地阻斷癌症的發生，起到治療疾病的作用，此文章首次通過動力學模擬和結合自由能計算等方法闡明了此過程的機理並為新一代抑制劑的研究提供參考。本工作不僅為調控靶標Hsp90在腫瘤中的藥物研發開闢了全新的思路，而且提供了優質的先導化合物，為阻斷Hsp90-Cdc37蛋白-蛋白相互作用提供了重要的藥理學證據和優質的小分子先導化合物 。
參考文獻：
1. Wang L, Li L, Gu K, et al. Targeting Hsp90-Cdc37: A Promising Therapeutic Strategy by Inhibiting Hsp90 Chaperone Function. Current Drug Targets 2017;18:1572-85.
2. Wang L, Li L, Zhou Z H, et al. Structure-based virtual screening and optimization of modulators targeting Hsp90-Cdc37 interaction. Eur J Med Chem 2017;136:63-73.
3. Verba K A, Wang R Y R, Arakawa A, et al. STRUCTURAL BIOLOGY Atomic structure of Hsp90-Cdc37-Cdk4 reveals that Hsp90 traps and stabilizes an unfolded kinase. Science 2016;352:1542-47.
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