先睹為快
靶點
DNA解旋酶（DNAgyrase），拓撲異構酶IV（topoisomerase IV）
篩選化合物庫
商業資料庫，公司內部資料庫共30000化合物
計算方法
分子對接，藥效團篩選，三維形狀相似度，分子動力學模擬
計算軟體
Glide，Phase，Desmond
單位
義大利Angelini公司研發中心，美國薛丁格(Schrdinger)公司
發表雜誌
Journal of Medicinal Chemistry
背景
耐藥細菌，甚至是「超級細菌」的泛濫，給全球健康帶來了沉重的負擔。在與其鬥爭的過程中，科研人員不僅需要發現新型有效的抗生素，還需要從耐藥機制入手研發新的抗菌化合物，以減少出現耐藥性的可能性，提高抵抗持續感染的活性，並提高安全性。在所有經過臨床驗證的靶標中，細菌IIA型拓撲異構酶家族的DNA促旋酶和拓撲異構酶IV引起了科研界極大的關注。氟喹諾酮類藥物經充分驗證且作為治療細菌感染的一線藥物已有50多年歷史，但最近累積的突變使細菌對這類療法產生了耐藥性。於是一些製藥公司轉而開發非氟喹諾酮的新型細菌IIA型拓撲異構酶抑制劑（NBTI）且於2010年公布了NBTI與金黃色葡萄球菌DNA促旋酶的作用機制，但NBTI與其他細菌的DNA促旋酶及拓撲異構酶的結合方式尚不清楚。考慮到大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的IIA型拓撲異構酶有較高的序列同一性，且多靶點配體在抗菌研究中有延遲耐藥性發生時間及獲得比單靶標劑更長壽命的優點，開發同時結合來自不同微生物種的DNA促旋酶和拓撲異構酶IV的小分子具有重要的廣譜抗菌治療前景。
虛擬篩選
義大利羅馬Angelini實驗室聯合Schrdinger公司的科學家收集了現有NBTI的資料庫，商業庫和企業庫中的3萬種化合物，首先用44個NBTI及Schrdinger的decoy數據集與唯一可用的NBTI和金黃色葡萄球菌DNA促旋酶的3D共晶結構（PDB code: 2XCS）對接以測試該晶體結構富集NBTI的能力，保證了結合模式上的整體相似性。然後通過基於結構的虛擬篩選，基於已知NBTI構建藥效團模型進行的虛擬篩選以及基於NBTI形狀的虛擬篩選共得到900個hits。NBTI由三個結構基序組成：（i）左側的不飽和雜環（LHS），（ii）右側的單環或雙環（RHS），（iii）主要是脂肪族的連接基團。成功的藥效團模型應該具有5個特徵：兩個氫鍵受體（A），一個環（R）模擬與DNA的相互作用，一個描述與Asp83相互作用的氫鍵供體（D）或者極性基團（P），一個芳香或者疏水環（R）代表位於蛋白質內部的疏水基團。
圖1. 化合物篩選優化流程(A)及NBTI結構組成(B)
圖片來源JMC
結構優化
從虛擬篩選得到的900個hits中選擇162個針對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的DNA促旋酶和拓撲異構酶IV進行酶活性實驗篩選。發現12種化合物在超螺旋和脫機測定中能抑制一種或兩種酶，化合物ID-130和ID-46對金黃色葡萄球菌的DNA促旋酶和拓撲結構酶IV的IC50在分別在30和500μM級別，產生了雙重抑制作用，且ID-130對兩種大腸桿菌均具有抗菌活性。通過將ID-130與金黃色葡萄球菌DNA促旋酶共結晶，通過X射線晶體學分析確認了化合物與公開發表的NBTI有類似的與靶標結合的構象，晶體結構甚至保留了藥效團建模時的相互作用。
圖2. 化合物1的設計思路(A)及ID-130-金黃色葡萄球菌拓撲異構酶IV複合物晶體結構(B)
圖片來源JMC
基於ID-130和ID-46，設計出了化合物1，對金黃色葡萄球菌的拓撲異構酶IV的IC50達到了90μM，對其他三種酶的抑制活性在0.5-14μM。顯示出良好的多靶點特徵且證實了應用合併策略的價值。對1的LHS,RHS和連接基團的構效關係研究（SAR）發現化合物(±)-33,(±)-35,和(±)-36可以有效靶向待測細菌菌株中的DNA促旋酶和拓撲異構酶IV，而氟喹諾酮類藥物優先靶向革蘭氏陰性菌中的DNA促旋酶和革蘭氏陽性菌中的拓撲異構酶IV。上述三個化合物比氟喹諾酮類化合物具有獨特的作用機理和更平衡的活性。
圖3.MD模擬化合物35與金黃色葡萄球菌DNA促旋酶的蛋白-配體相互作用
圖片來源JMC
計算流程
第一輪對篩選庫中3萬化合物用Glide進行虛擬篩選，晶體結構選擇金黃色葡萄球菌的DNA促旋酶結構與GSK299423的複合物（PDB code：2XCS）。通過目測檢查與結合位點的關鍵相互作用以及對接分數，選擇與中間的氨基有相互作用且docking score≤-7.00 kcal/mol的500個化合物。為了避免只用一個晶體結構帶來的計算偏差，從文獻中選擇了8個NBTI，用Schrodinger的Phase程序對其進行仔細評估，生成了兩個基於已知NBTI結構的藥效團模型，用這兩個模型對3萬化合物庫進行第二輪篩選，得到了約200個全部符合藥效團特徵的化合物。第三輪篩選採用Phase程序的phase_shape組件對化合物庫進行基於形狀的篩選，考慮了兩種基於形狀的篩選方法：基於藥效團的和基於原子類型的形狀篩選，觀察到重疊程度最高的數據集的前2%中存在大量的活性化合物，此輪篩選出大約200個化合物。將三輪篩選得到的900種化合物進行聚類分析以獲得化合物的高多樣性，去掉冗餘，最終選擇了162種化合物。為了評估溶劑對化合物1及經SAR優化後的化合物與靶點結合親和力的貢獻，使用了Schrodinger的WaterMap程序研究溶劑化效應和去溶劑化對結合能的影響，查明複合物中水分子的熱力學性質。對於Linker處結構修飾的研究，將準備好的複合物轉化為完全溶劑化的系統，使用Desmond系統進行分子動力學模擬以捕獲離散水對化合物與關鍵殘基Asp83相互作用的貢獻。
總結
本文利用基於結構和基於藥效團和形狀虛擬篩選手段，篩選了30000種化合物的庫，鑑定了適合優化的不同於氟喹諾酮類化合物作用機理的兩個化合物系列。通過解析與金黃色葡萄球菌DNA促旋酶結合的晶體結構驗證了模型有效性。運用構效關係研究進行結構優化，得到了3個具有多靶點活性的NBTI，對代表性革蘭氏陰性和陽性病原體及抗性菌株表現出優異的功效，可為將來開發抗感染藥物奠定基礎。
參考文獻:
Magaro G, Prati F, Garofalo B, et al. Virtual Screening Approach and Investigation of Structure-Activity Relationships To Discover Novel Bacterial Topoisomerase Inhibitors Targeting Gram-Positive and Gram-Negative Pathogens. J Med Chem 2019;62:7445-7472