許多人知道一句話，「沒有氧氣人活不了，沒有氫氣人活不好」，今天關於氧氣的研究獲得了大獎，給這句話有增加了新的話題。其實關於氧氣代謝的研究，歷史上已經有過2次獲得諾貝爾生理或醫學獎了。第一次是氧氣如何被細胞利用。第二次是身體如何感受到低氧，並通過神經反射對心肺功能進行調節。這次是第三次是細胞如何感受到氧氣不足，並通過關鍵轉錄因子調節細胞內基因表達，這種反應也能影響到體內氧氣的運輸能力。氧氣約佔地球大氣成分的21%，對動物生命至關重要，幾乎所有動物細胞中的線粒體都會利用氧氣，將有機物轉化為能量。德國著名生理學家Otto Warburg 是 1931 年諾貝爾生理學或醫學獎獲得者，他揭示線粒體內存在細胞色素氧化酶，就是氧氣被利用的酶。傑出的德國生物化學家瓦勃Otto Heinrich Warburg機體逐漸進化出確保向組織和細胞充分供氧的機制。頸動脈體與頸部兩側大血管相鄰，包含專門感應血液中氧氣水平的細胞。1938 年，Corneille Heymans 獲得的諾貝爾生理學或醫學獎，獎勵他發現了頸動脈體和主動脈體感知血氧水平並通過神經中樞調節呼吸頻率的作用。2019諾貝爾獎生理學或醫學獎授予威廉·喬治·凱林（William G. Kaelin, Jr.）、彼得·約翰·拉特克利夫（Sir Peter J. Ratcliffe）、格雷格·倫納德·塞門扎（Gregg. L. Semenza），以表彰三位在人及大多數動物細胞感知、適應氧氣變化機制方面做出傑出的貢獻。以下內容是2016年寫的，主要就是介紹2019年獲獎的背後故事，值得閱讀。2016年9月22日，Thompson教授在《細胞》發表題為「Into Thin Air: How WeSense and Respond to Hypoxia」的評述文章，介紹了今年拉斯克獎基礎醫學研究獎關於「人與動物對氧氣含量的細胞感知機制」。Gregg Semenza也寫了關於低氧誘導因子發現的背後故事。本文根據這兩個文獻為主要參考，整理成本文，以讓大家對這個故事有一個比較全面的了解。2016年拉斯克基礎醫學獎被William Kaelin、Peter Ratcliffe和Gregg Semenza三位分享，以獎勵他們在發現動物細胞感受和適應氧氣水平改變的分子機制，氧氣感受信號系統在許多生理和病理過程中發揮關鍵作用。一、Semenza和低氧誘導因子中學生都知道，氧氣對生命十分重要。每次呼吸，氧氣被吸收進入血液，二氧化碳被釋放到空氣。氧氣是能量代謝的關鍵成員，能量代謝是是4萬億細胞維持功能和生存的基礎。細胞產生ATP有兩個基本方式：需要氧氣的氧化磷酸化和不需氧氣的糖酵解。但是不需氧氣的糖酵解產生ATP的效率非常低下，無法長時間維持，因此需要氧氣的氧化磷酸化為細胞最基本的能量代謝模式。細胞一般利用葡萄糖作為能量代謝的原料，也能利用脂肪酸和胺基酸為原料。複雜的神經系統和肌肉運動需要大量的能量，如果ATP產生的效率不高，這些器官無法順利完成正常功能。因此多細胞動物生命必然具有滿足能量代謝需要的高效率利用氧氣的能力。這也是研究細胞營養物質氧化產生ATP的過程能多次獲得大獎的原因。但人們認識到大腦、心臟和肌肉主要依靠有氧代謝產生能量，關於氧氣運輸蛋白如血紅蛋白和肌紅蛋白的發現和特徵的研究又成為獲獎對象。雖然對需氧代謝和氧氣運輸的問題被逐漸解決，但關於氧氣代謝的一個重要側面，細胞感受和適應氧氣的信號系統上世紀末才開始被逐漸弄清楚，這一信號系統會對環境缺氧和呼吸循環血液系統功能障礙產生顯著改變。2016年的拉斯克基礎醫學獎正是給了三位發現動物細胞內氧氣感受系統的科學家。WilliamKaelin、Peter Ratcliffe和 Gregg Semenza是獨立開展研究的科學家，但是他們的工作是關於細胞感受氧氣的一個整體系統。該發現的源頭是關於一個蛋白的研究，這種蛋白是促紅細胞生成素（Erythropoietin促紅素），肝臟和腎臟細胞合成的促紅素作用是一種激素，基本功能是促進骨髓內紅細胞生成，這樣可以提高血液運輸氧氣的能力。Semenza對這個基因研究一段時間後，興趣逐漸轉移到這個基因表達的調節機制，這一興趣轉移打開了這個領域的一扇窗口。利用轉基因小鼠，1992年他和學生王廣良在肝臟細胞的促紅素基因的3』端增強子區發現一段低氧反應元件，這暗示存在一種轉錄因子能結合這個區域促進促紅素基因表達。經過反覆探索，1995年他們純化到這種轉錄因子，這是一種二聚體蛋白，因為在低氧條件下發揮轉錄促紅素基因的作用，被命名為低氧誘導因子。最近Semenza對轉錄因子發現過程的回顧，他說杜克大學醫學院畢業前，他對醫學遺傳學產生了興趣，1986年來到現代醫學遺傳學之父維克多工作過的霍普金斯深造，當時他投奔的老師是海哥和史泰龍。那個時代轉基因小鼠剛剛興起，根據兩個導師的興趣， Semenza 準備研究凝血因子8基因。正好那時遺傳所強克博士克隆了因子8基因，Semenza去找強克幫忙要一些基因組克隆。不過強克建議他考慮研究另一個已經被他克隆好的促紅素基因（是瞎貓？）。促紅素是血液激素，胚胎期在肝臟產生，成年後轉移到腎臟。血液中的促紅素能作用在骨髓中的紅細胞祖細胞，刺激這種細胞產生更多紅細胞。尿毒症患者腎臟合成促紅素的能力下降會發生嚴重貧血，只能通過輸血治療。可以用基因工程技術用促紅素基因人工合成促紅素，治療尿毒症貧血顯然是一味良藥。Semenza開始興趣是希望弄清楚，為什麼胎兒時期在肝臟表達的促紅素成年後怎麼轉移到腎臟？他推測這個基因存在多個不同的增強子，這樣在不同生理條件下，條件這個基因在不同部位表達。但是這個基因顯然還受到低氧因素的調節，這對研究這個基因帶來很大挑戰。剛涉足科研的青年人Semenza不懂轉基因技術。在生理系約翰教授幫助下，Semenza建立了促紅素轉基因小鼠。這個小鼠的表現符合預期，能讓動物產生更多紅細胞，也說明這個轉基因是成功的。通過設計具有不同DNA長度片段的轉基因小鼠，他們驗證了最初的想法。就是促紅素在肝臟和腎臟等不同組織的差異表達主要受到該基因3』和5』區域調控。回答了為什麼胚胎和成年時期促紅素在不同器官表達的疑問後。Semenza下一步的目的就是試圖回答該基因生理調控的機制。利用哈羅德建立的核酸酶敏感分析實驗，尋找調控促紅素表達的瞬式作用元件，Semenza將人源促紅素轉基因小鼠肝臟細胞核提取出來，發現人源促紅素基因超敏點在於3』端。這一段序列正好囊括了低氧反應元件，即一段對低氧非常敏感的基因轉錄活性序列。Semenza等猜想，存在一種和低氧反應元件互補的成分能激活促紅素基因表達。可以說這個時候他們發現了一種工具，然後利用這個工具找到了一種神奇的分子。隨後進行了一系列的「電泳遷移」實驗，就是把包含低氧反應元件的DNA雙鏈進行同位素標記，尋找能結合這個低氧反應元件的目標蛋白。實驗的關鍵是需要小心去除非特異性結合蛋白，否則可能是錯誤的目標。這時Semenza晉升為課題組長，招收了第一個博士後王廣良。王廣良博士每天都重複凝膠遷移實驗，嘗試不同的鹽濃度和DNA片段。開始數周都是陰性結果，無法區分低氧條件和對照組之間的差異。數周后的一天，Semenza看到非常美麗的凝膠遷移膠片。Semenza對著螢光燈，一個接一個的仔細檢查，努力尋找低氧和對照組之間的區別，直到我發現有一條條帶發生略微遷移。他們終於找到了夢寐以求的那個隱藏在眾多分子之間被低氧誘導出的蛋白條帶。王光立刻開始了新一輪重複實驗，通過優化條件，一周內就獲得了更加令人信服的一條清晰的條帶。這就是Semenza等一直苦苦尋找的具有DNA結合活性的低氧誘導因子-1。接著鑑定這一蛋白質特性，他們再次遇到挫折。恰好附近的卡內基研究所史蒂夫開發了一種技術，通過利用重組噬菌體表達哺乳動物cDNA結合放射性寡核苷酸篩選技術，檢測能夠與探針相結合的蛋白質。與史蒂夫合作篩選了成千上萬的噬菌體，但一無所獲。沒有辦法只能退回到經典辦法，把這個目標蛋白質純化出來。但是這種技術對Semenza來說完全陌生，而且實驗條件也不完善，這幾乎是難以完成的任務。Semenza當時獲得了馬克慈善基金會資助，每年所有基金獲得者都會聚在一起開個年會。那一年，喬做了一個令人印象深刻的晚宴致辭，他強調在追尋問題答案時，需要一種「技術上的勇氣」，即便這些技術不是自己所擅長的，這些話給了Semenza很大的鼓舞。另外他幸運地認識了霍普金斯分子生物學與遺傳學系的湯姆，他是第一個成功純化DNA相結合蛋白質的分子生物學家。在湯姆的幫助和技術支持下，對野生型和突變型細胞核提取物進行DNA親和層析實驗，初步實驗數據表明有兩個多肽共同與我們的靶向DNA序列相結合，分別稱為低氧誘導因子1α和β。這種異二聚體蛋白，採用噬菌體表達單個多肽的篩選法，顯然是南轅北轍。因為必須是兩個蛋白一起才能結合目標DNA序列，一個分子再多也沒有用，所以說選擇合適的技術有時候對科研是非常關鍵的。這時他們已經發現所有哺乳動物細胞都可以找到低氧誘導因子1蛋白，通過擴大純化規模，獲得了足夠量的低氧誘導因子1α和β，在維斯塔研究所大衛實驗室幫助下，對這些蛋白進行了序列分析。1995年，他們獲得這個蛋白的序列，然後發現其中β就是奧利弗發現並被命名為芳香烴受體核轉運子ARNT。不過低氧誘導因子1α沒有在過去的基因庫中發現類似的結構，隨後他們用低氧細胞cDNA文庫成功克隆了低氧誘導因子1α的cDNA。這種蛋白的發現和cDNA序列的克隆，極大地推動了低氧誘導因子的功能研究，隨後世界各地學者先後在發育生物學、生理學、醫學以及進化學等方面分別取得了進展。二、從低氧誘導因子到低氧感受器剛開始發現低氧誘導因子1時，Semenza並沒有完全意識到這個蛋白功能的重要性，而是推測這個蛋白可能不僅僅調節促紅素基因表達。1996年發表了一個關鍵發現，是他們證明低氧誘導因子1也能誘導血管內皮細胞生成因子基因表達，這是負責血管生成的分子。血管生成和紅細胞生成代表兩個低氧反應的重要類型，這說明低氧誘導因子1是細胞感受低氧的中心分子。為了確認低氧誘導因子1在這些器官中的作用過程，Semenza製備了低氧誘導因子1基因敲除小鼠。1998年發表的結果發現，這種動物存在血管發育和氧依賴基因表達的嚴重缺陷，在子宮內就發生死亡。在Semenza發現基礎上，Peter Ratcliffe對低氧誘導因子進行了更深入研究。長期以來，科學家一直認為氧氣的感受只是少數細胞特有的能力。例如在頸動脈體和主動脈體就存在感受血液中氧氣濃度的化學感受器，能通過神經反射調節呼吸頻率和血壓。但是Ratcliffe等1993年的研究發現，許多細胞內低氧反應元件DNA結合活性受到氧濃度調節，說明低氧誘導因子是許多細胞感受低氧的共同分子。1994年Ratcliffe進一步用糖酵解酶也受到低氧反應元件調節確定了這一判斷。糖酵解也是細胞對低氧的一類反應，但和血管生成和紅細胞生成屬於長期低氧效應不同，糖酵解屬於快速低氧反應。這說明低氧誘導因子不僅負責調節長期低氧反應，也是急性低氧反應的調節因子。三、從臨床疾病出發不同於Semenza和Ratcliffe，Kaelin教授是研究癌症的臨床醫生。在臨床實習階段，Kaelin就知道某些腎臟腫瘤能促進血管形成，這些腫瘤細胞失去一種抑癌基因VHL，VHL最早是在von Hippel-Lin- dau症候群患者被確定的，因此命名為VHL。但是克隆VHL並沒有提供任何分子功能的幫助。1995年，Kaelin小組發現VHL蛋白能與延伸因子B、延伸因子C和CUL2形成複合物。因為延伸因子C和CUL2和酵母蛋白SKP1和Cdc53同源，提示VHL蛋白／延伸因子／CUL2複合物可能是一種泛素連結酶。泛素連結酶與腎臟腫瘤血管增生怎麼有關係？Kaelin推測VHL缺乏可能會讓細胞產生更多內皮細胞生長因子，後者是造成血管大量產生的原因。不過他卻發現，VHL缺陷能導致低氧誘導因子調控基因表達上調，這些基因剛剛被Ratcliffe和 Semenza發現，其中包括內皮細胞生長因子基因。四、確定氧氣感受器既然泛素連結酶活性下降也能激活低氧誘導因子，那麼低氧誘導因子可能受到泛素連結酶的調節。Ratcliffe和Kaelin都想到一種簡單漂亮的翻譯後調節模式。PeterRatcliffe回憶自己開展氧感受研究的過程，是從上個世紀80年代開始。臨床上低血壓患者經常發生腎損傷，作為腎內科醫生，Ratcliffe希望深入理解休克為什麼更容易造成腎臟損傷。從這種研究中，他對在低氧分壓而不是血流量降低導致腎臟促紅細胞生成素合成增加的現象產生了興趣。人們認為這可能與腎臟不同尋常的循環有關，特殊循環導致腎中心組織氧張力非常低，但他經過研究並沒有確定這種關係。他考慮的另外一個角度是研究氧感受過程，認為腎臟在氧氣感受方面具有獨特性是腎臟對缺氧更敏感的原因。從此以後他就一直關注氧感受的問題。Kaelin最近回憶自己如何從事氧感受研究。當他在約翰霍普金斯醫院的住院總醫生時，比較偏愛研究一種罕見病VHL症候群，因為這這能提高他在學生們面前的權威性，可以提問實習生這個疾病的有關問題。臨床醫生傾向於記住各種症狀，以及造成這些症狀的可能原因。但VHL基因被克隆時，他早就知道某些腎癌與該基因有關，也知道那些腫瘤有非常豐富的血管，患者體內偶爾產生過多紅細胞。。因此認為研究VHL將能有助於理解這種腎癌，也可幫助理解血管生成的道理。因為血管生成和紅細胞生成的共同點都可由缺氧誘導。Kaelin認為，VHL病好像讓身體不斷誤以為缺氧並發出求救信號，這種信號通常是真正缺氧的信號。弄清楚這個道理，可以幫助人們理解氧的感受方式。他們首先證明，VHL能發揮E3泛素連結酶作用，將低氧誘導因子1α泛素化，一旦低氧誘導因子1α泛素化就會發生降解。在2001年的背靠背論文中，Ratcliffe和Kaelin分別報導，存在氧氣的條件下，低氧誘導因子1α發生脯氨酸羥化，脯氨酸羥化是低氧誘導因子1α和VHL結合併泛素化降解的條件。接下來的問題是，低氧誘導因子1α脯氨酸羥化是如何實現的。Ratcliffe、Kaelin和Steve McKnight三家實驗室獨立報導了這種脯氨酸羥化酶。另外一個調節低氧誘導因子1α轉錄活性的是天冬氨酸羥化酶，天冬氨酸羥化能阻斷低氧誘導因子1α招募轉錄共激活因子。這兩個羥化酶都需要氧氣作為反應底物，氧氣存在時，脯氨酸羥化，低氧誘導因子1α被降解，天冬氨酸羥化低氧誘導因子1α活性下降；缺氧時羥化酶失去活性，促進降解和抑制活性的過程都被抑制，結果是低氧誘導因子1α水平增加活性增強。這樣就徹底找到氧氣的感受器脯氨酸羥化酶和天冬氨酸羥化酶。五、羥化酶也能感受氧化應激低氧誘導因子1α羥化酶能感受氧氣水平，其實這種酶的底物不僅只有氧氣，還有鐵離子、維生素C、α酮戊二酸等，氧氣水平影響這種酶活性，其他代謝物質也可能同樣有這種作用，那麼這種酶也許是這些代謝物感受器。在這種酶剛被確認為氧氣感受器後不久，就有研究證明其他一些代謝物也能調節這種酶活性，羥化酶包括活性中心的鐵離子，反應底物是氧氣和α酮戊二酸，反應產物是琥珀酸和二氧化碳。低氧情況下持續抑制羥化酶活性部分是因為乳酸脫氫酶將α酮戊二酸轉化為L2羥基戊二酸，結構類似的L2羥基戊二酸能競爭抑制α酮戊二酸和羥化酶的結合發揮抑制作用。這些發現符合某些人類腫瘤血管大量增加的表現，這些腫瘤細胞的琥珀酸脫氫酶或延胡索酸酶基因突變導致功能喪失，這導致常氧條件下低氧誘導因子1α水平增加。這些酶缺乏，會造成三羧酸循環代謝物琥珀酸或延胡索酸積累，這些代謝物可抑制羥化酶活性，產生類似低氧的效應。低氧誘導因子1脯氨酸羥化酶也具有氧化還原感受作用，鐵離子和半胱氨酸是低氧誘導因子1三維結構維持功能的關鍵因素，都會受到細胞線粒體氧化還原狀態影響。氧化還原敏感性使脯氨酸羥化酶不僅是低氧耐受的關鍵，也是能量代謝和氧化平衡的關鍵。在這種情況下，低氧誘導因子1誘導丙酮酸脫氫酶激酶的表達，抑制三羧酸循環，同時誘導乳酸脫氫酶A使丙酮酸轉化為乳酸釋放到細胞外（浙大小蘇打抗癌的理論基礎）。因此，低氧誘導因子1不僅使細胞耐受低氧，也能使細胞耐受營養過剩，使細胞從需氧的氧化磷酸化轉變為糖酵解代謝模式發揮抗氧化應激作用。六、羥化酶是代謝狀態感受器低氧誘導因子1脯氨酸羥化酶活性在氧濃度生理效應調節重要作用的發現，讓人們對氧氣的其他細胞功能調節產生了興趣。許多氧分子依賴的酶被推測也具有低氧感受和調節能力，例如DNA胞嘧啶甲基羥化酶TET和含有Jumonji C結構域的組蛋白去甲基化酶都類似於脯氨酸羥化酶。這些催化DNA和蛋白甲基化的羥化酶和脯氨酸羥化酶一樣，都需要α酮戊二酸和氧分子為底物完成羥基化和脫羧基催化反應。因為這些酶催化的反應細胞表觀遺傳學的重要調節方式，對染色體結構會產生影響，這些發現能解釋為什麼大多數成年哺乳動物組織內幹細胞總是分布在相對低氧的巢內。異檸檬酸脫氫酶1或2發生突變，會導致這些依賴α酮戊二酸的雙加氧酶功能下降，影響組蛋白和DNA甲基化作用，並導致組織癌變。異檸檬酸脫氫酶突變可引起合成羥基戊二酸的酶活性代償性提高，羥基戊二酸能與α酮戊二酸競爭與羥化酶的結合，導致組蛋白和DNA甲基化作用被抑制。這些結果提示，依賴α酮戊二酸的雙加氧酶不僅是多細胞生物用於感受低氧的關鍵分子，也是在營養狀態不良或缺氧情況下調節胚胎發育和分化的關鍵分子。