NCB | Brangwynne組發現轉錄凝聚物放大基因表達

撰文 | 十一月

通過液-液相分離（Liquid-liquid phase separation）形成的無膜細胞器或者凝聚物（Condensates）被認為是從核仁到轉錄凝聚物中基因轉錄的基礎【1-3】。轉錄凝聚物被認為在基因組特定位點發生相分離並促進與基因表達相關的生物分子的相互作用。但是到目前為止，鮮有關於活體細胞中將動態轉錄輸出與相分離過程連接起來的定量模型。

近日，美國普林斯頓大學Clifford P. Brangwynne研究組在Nature Cell Biology雜誌上發表文章Nucleated transcriptional condensates amplify gene expression，通過光遺傳學的方式對FET家族轉錄調節因子在活細胞中的相分離傾向進行記錄和展示，同時對FET家族中的TAF15因子通過獨特的電性分布特徵與RNA Pol II的C端結構域CTD相互作用降低TAF15發生相分離的能量勢壘，從而進一步地通過招募RNA Pol II驅動轉錄輸出，建立起了一個定量監測轉錄因子元件驅動特定位點相分離從而放大基因表達的正反饋環路模型。

轉錄凝聚物和其他的一些細胞核小體富含一些包含內在無序序列（Intrinsically disordered regions, IDRs）的核酸結合蛋白【4】。其中包含FUS的FET蛋白家族尤其引發科學家的研究興趣。FET蛋白家族除了FUS之外還包含EWT以及TAF15。以上三個蛋白的N端均富集不帶電的極性胺基酸以及芳香族胺基酸、一個RNA識別基序以及精氨酸和甘氨酸富集結構域。體外蛋白純化的實驗開始對於這些胺基酸在分子相互作用以及結合特異性方面的功能進行鑑定，但是這些序列編碼的相分離行為是否會功能性地影響轉錄動力學的變化還不得而知。

為了解決FET蛋白家族的序列特異性依賴對轉錄功能的影響，作者們使用他們實驗室先前建立的optoDroplet系統【5】進行檢測，該系統利用藍光控制多聚化的隱花色素蛋白（Cryptochrome 2, Cry2）來控制蛋白質無序序列的多聚化，檢測蛋白片段驅動相分離的潛力（圖1）。與先前結果相似【5】，optoFUS可以在細胞核和細胞質中均出現誘導的相分離液滴的現象（圖1）。之所以在細胞核和細胞質中均有相分離的液滴形成，是因為N端的IDR區域不包含入核序列。對於這種雙重定位作者們認為可以對不同空間的相分離行為進行比較，一方面是在細胞質中IDR序列本身所具有的相分離特性，另一方面對細胞核中被調控的相分離行為進行研究，比如在此構成中翻譯後修飾以及內源核相互作用因子的存在對細胞核部分中蛋白相分離行為的影響。

圖1 利用optoDroplet系統檢測FET蛋白家族IDR區域發生相分離的特性

先前的研究表明，IDR區域的芳香族胺基酸尤其是酪氨酸對於IDR介導的相分離作用非常關鍵。為了對FET家族蛋白中IDR區域的酪氨酸功能進行解析，作者們對這三個蛋白IDR區域的酪氨酸進行了突變。在對optoDroplet系統檢測相分離特性結果中，作者們發現了一個非常有趣的現象，TAF15的IDR在細胞質與細胞核中的相分離的傾向是不同的，與其他的FET家族蛋白相比，TAF15在細胞質中發生相分離的傾向要弱很多。作者們對這些蛋白序列進行分析後發現，TAF15的IDR區域與其他蛋白相比包含很多的帶電胺基酸（TAF15 IDR=35；FUS IDR=6；EWS IDR=7）。這引起的作者們的研究興趣，為了對這些帶電胺基酸對optoTAF15在細胞核與細胞質中相分離行為不同的影響，作者們對optoTAF15中的帶電胺基酸進行突變將其變為不帶電的胺基酸，結果作者們發現正是這些帶電胺基酸的存在降低了TAF15 IDR在細胞質中發生相分離傾向。

進一步地，作者們對TAF15在細胞質中相互作用強度增加以及形成凝聚物的偏好性形成的根源進行探究。TAF15是一個關鍵的轉錄調控因子並且被發現與RNA Pol II CTD存在相互作用【6】。隨後作者們對CTD區域與optoTAF15進行共表達，發現在藍光誘導的情況下CTD穩定地被TAF15所招募。Pol II的CTD區域會經歷周期性的包括磷酸化在內翻譯後修飾來調節轉錄活性【6】，而磷酸化過程會改變電性依賴的相互作用。因此，作者們對TAF15 IDR區域電性對於招募CTD的影響進行檢測，發現帶電數降低的突變型TAF15 IDR 對CTD的招募顯著降低。因此，作者們認為電性介導的TAF15與CTD之間的相互作用對TAF15在細胞質與細胞核中不同的相分離行為可能具有一定的貢獻。

隨後作者們想知道CTD的磷酸化狀態是否會影響optoTAF15的相分離。作者們對CTD的激酶進行加藥抑制後發現，未發生磷酸化的CTD與optoTAF15的相互作用更強，從而增強細胞核中的相分離行為。因此，CTD地磷酸化程度會調節轉錄因子的IDR在細胞核中的相分離。

隨後作者們對高濃度的CTD對於TAF15富集的凝聚物成核的作用檢測，作者們使用了一個穩定地將CTD表達在端粒的系統，將端粒相關蛋白TRF1與eGFP-CTD進行融合（TRF1-CTD）。TRF1-CTD能夠在端粒處形成點狀凝聚物，而且通過抗體的染色體作者們發現內源的TAF15會被強烈地招募到TAF15凝聚物處。為了進一步Pol II CTD的內源不同狀態對TAF15凝聚物招募Pol II 的影響，作者們使用CTD本身、Ser5位磷酸化的CTD以及Ser2位磷酸化的CTD抗體對Pol II在optoTAF15凝聚物處的分布進行檢測（圖2）。通過該實驗作者們發現，TAF15凝聚物會招募CTD本身而非磷酸化狀態的CTD。因此，TAF15的凝聚物更更傾向於與顯示轉錄起始而非轉錄延伸狀態的Pol II結合。

圖2 CTD本身與TAF15共定位而磷酸化狀態到的CTD環繞在TAF15凝聚物之外

總的來說，Clifford P. Brangwynne研究組的工作發現Pol II的CTD會招募以促進FET家族蛋白的成核作用促進相分離凝聚物的產生，放大活躍轉錄位點驅動進一步的轉錄延伸。CTD被磷酸化後可以從凝聚物中釋放出來進行轉錄延伸過程，最終促進凝聚物不穩定性的產生，達到轉錄激活的動態調控。

圖3 工作模型

原文連結：

https://doi.org/10.1038/s41556-020-00578-6

參考文獻

1.Brangwynne, C. P. etal. Germline P granules are liquid droplets thatlocalize by controlled dissolution/condensation. Science (New York, N.Y.) 324,1729-1732, doi:10.1126/science.1172046 (2009).

2.Li,P. et al. Phase transitions in theassembly of multivalent signalling proteins. Nature 483, 336-340,doi:10.1038/nature10879 (2012).

3.Shin,Y. & Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology anddisease. Science (New York, N.Y.) 357, doi:10.1126/science.aaf4382(2017).

4.Feric,M. et al. Coexisting Liquid Phases UnderlieNucleolar Subcompartments. Cell 165, 1686-1697,doi:10.1016/j.cell.2016.04.047 (2016).

5.Shin,Y. et al. Spatiotemporal Control ofIntracellular Phase Transitions Using Light-Activated optoDroplets. Cell 168, 159-171.e114, doi:10.1016/j.cell.2016.11.054 (2017).

6.Kwon,I. et al. Phosphorylation-regulatedbinding of RNA polymerase II to fibrous polymers of low-complexity domains. Cell 155, 1049-1060, doi:10.1016/j.cell.2013.10.033 (2013).