NCB|楊輝/周海波組開發新型基因表達動態示蹤技術

責編 | 兮

在活細胞中實時監測內源基因活性對於研究基因的生物學功能及其表達水平至關重要。基因組中編碼蛋白質的基因只有1%-2%，大部分為非編碼RNA。其中lncRNAs(Long non-coding RNAs)具有非常重要的調控功能， 多達78% 的lncRNAs表達具有組織特異性【1】。近年來越來越多證據表明，lncRNAs不僅參與各種生物學過程和通路，而且與各種疾病的發生發展緊密相關。但是受現有標記技術的限制，對其功能注釋極具挑戰性。

監測內源基因活性的常規方法是將螢光蛋白精確插入蛋白編碼框中，但是，這種方法並不適用於非編碼基因和低豐度轉錄的基因。sgRNA，類似於一個GPS可以將Cas核酸酶直接導向目標核酸位點，具有高特異性、高效率和多功能性【2】。儘管各種誘導性sgRNA已經被開發用來接收活細胞中的內源信號，但這些方法只能用於某些功能明確的小RNA的反應【3-5】。目前在活細胞裡面標記內源基因表達的方法，都具有一定的局限性，而且，對於低表達的基因以及lncRNA，目前缺乏很好的活細胞內的標記技術。建立適用範圍更廣，能增強內源信號，並且信噪比更低的新型活細胞標記技術，是該研究領域急需解決的問題。

2021年1月4日，中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）、上海腦科學與類腦研究中心、神經科學國家重點實驗室楊輝研究組和周海波研究組合作在Nature Cell Biology在線發表了題為「Endogenous promoter-driven sgRNA for monitoring the expression of low-abundant genes and lncRNA」的研究論文。該研究通過內源基因的啟動子驅動sgRNAs（single-guide RNAs）表達，結合SPH-OminiCMV（CRISPR-activator Suntag-P65-HSF1 and OminiCMV-mCherry）螢光報告系統【6】，成功實現低豐度基因和lncRNAs基因表達的動態示蹤。該研究建立了一種通用的內源基因轉錄門控系統，為活細胞中實時標記低表達基因和lncRNAs，研究其生物學功能提供了有效工具。

該研究中，研究人員首先優化了高度敏感的CRISPR激活相關的報告系統，命名為SPH-OminiCMV。然後在小鼠胚胎幹細胞上建立了SPH-OminiCMV的穩轉株（圖1A），接著選擇在Actb基因的第一個內含子區域用SaKKHCas9介導了三種不同的sgRNA釋放機制，分別是：miR30【7】, autosplicing【8,9】or tRNA【10-12】（圖1B）。結果顯示只有tRNA能夠有效地誘導報告系統中的mCherry表達。如先前報導的【10-12】，可以將tRNA-sgRNA-tRNA前體插入外源基因中，並通過內源酶RNase P和RNase Z在特定位點精確切割，然後釋放sgRNA。那麼，在內源基因的什麼位置導入tRNA-sgRNA-tRNA前體才能誘導報告系統更好的表達呢？以及是否會對內源基因的表達造成影響呢？為了回答這兩問題，研究人員在Nanog基因的不同位點導入tRNA-sgRNA-tRNA前體，實驗結果顯示在3』UTR的效果更好並且更加穩定，並且western blot的結果顯示對內源基因的表達量基本沒有影響（圖1C-F）。

圖1：（A）小鼠胚胎幹細胞上建立了SPH-OminiCMV穩轉株。（A）在Actb的第一個內含子導入三種不同的sgRNA釋放機制。（C）在Nanog基因的不同位點導入tRNA-sgRNA-tRNA前體。（D）不通導入位點誘導報告系統mCherry的表達情況。（E）Nanog基因的不同位點導入tRNA-sgRNA-tRNA前體後對nanog的蛋白表達量進行檢測。

就此楊輝研究組和周海波研究組合作開發了一種廣譜的內源性轉錄門控開關Ents（Endogenous Transcription-Gated Switch），利用內源性啟動子表達sgRNA前體，之後sgRNA前體上的tRNA序列可以被內源的自剪切機制識別並且切割，進而釋放出能夠執行功能的sgRNA，當Ents與高度敏感的CRISPR激活相關的報告系統SPH-OminiCMV結合，可以監測到內源基因的表達（圖2A）。值得注意的是，SPH-OminiCMV-Ents能夠放大內源信號，從而實現低豐度轉錄本表達的可視化。

為進一步研究SPH-OminiCMV-Ents用於監測內源基因的能力，團隊選取了表達量從高到低的八個基因，發現SPH-OminiCMV-Ents誘導的mCherry表達水平普遍高於常用的P2A-mCherry標記策略，尤其是P2A-mCherry策略標記後在螢光顯微鏡下幾乎無信號的低豐度表達基因Sox2、Tet1、Sall4、Tbx3等（圖2B）。

為探討增加sgRNA拷貝數是否會進一步增強螢光蛋白的產生，團隊構建了一個sgRNA前體，包含六到八個串聯的sgRNA拷貝，每個sgRNA的兩側分布著tRNA序列（圖2C）。研究表明，插入sgRNA陣列可以對低豐度基因實現更好的監測，比如lncRNATug1，當僅用一個拷貝的sgRNA的時候不能監測到其表達，但使用sgRNA陣列則可以（圖2D,E）。

為進一步探討此方法的特性，團隊成員建立了一個可控的Tet-on系統，該系統可以通過調節dox的濃度，實現EGFP基因不同程度的表達量，進而用來研究報告系統的螢光信號強度是否可以很好地反映目標基因的表達水平。研究發現，報告系統的mCherry表達量和EGFP基因的表達量有很強的相關性，並且進一步探索了此報告系統和目標基因表達在轉錄本水平和蛋白翻譯水平存在的時間差（圖2F）。

圖2：（A）示意圖顯示P2A-mcherry和SPH-OminiCMV-Ents兩種標記基因的策略。（B）在mESC細胞中用SPH-OminiCMV-Ents策略（紅色三角形）和P2A- mCherry策略（綠色菱形）標記不同的基因，統計其mCherry螢光信號強度以及用qPCR分析這些基因的表達水平（紫色圓圈，紫色y軸）。（C）示意圖顯示插入一個sgRNA或一個sgRNA陣列的標記策略。（D，E）Fish圖像顯示對lncRNA Tug1在3'UTR中插入一個sgRNA或一個sgRNA陣列後，細胞系中mCherry報告螢光信號的表達情況。（F）可控的Tet-on系統示意圖，Dox誘導EGFP-sgRNA前體轉錄，成熟的sgRNA釋放出來激活mcherry報告系統。

那麼對於內源基因的表達變化，該系統是否也能靈敏地檢測到呢？研究人員在體外對SPH-OminiCMV-Ents-Actb，Actb-P2A-mCherry，SPH-OminiCMV-Ents-Nanog 和Nanog-P2A-mCherry四株細胞系進行了分化實驗【13】。再分化進程中，Actb的表達量不會改變，Nanog的表達量逐漸降低，而報告系統的mCherry表達量和目的基因的表達變化是一致的，這說明這一系統能夠反映內源基因表達的動態變化（圖3A-D）。

圖3：（A）-(D) SPH-OminiCMV-Ents-Actb ，Actb-P2A-mCherry，SPH-OminiCMV-Ents-Nanog 和Nanog-P2A-mCherry四株細胞系在分化進程中，報告系統中mCherry的表達情況變化圖和Actb，Nanog內源基因mRNA水平表達的變化情況。

該研究創新開發了由內源性啟動子驅動的高度可編程的sgRNA門控開關Ents，此系統理論上可以處理任何轉錄本的信息。研究人員將Ents與SPH-OminiCMV結合使用，在小鼠胚胎幹細胞水平上實現了對低豐度基因和lncRNA的可視化監測及其動態變化的監測，未來的工作會進一步應用於動物體內。該研究為在活細胞中研究基因元件的功能開闢了新途徑，為描繪基因表達的時空圖譜和標記、鑑定特定的細胞類群帶來新方法。

原文連結：

https://doi.org/10.1038/s41556-020-00610-9

參考文獻

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