近日，中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所周斌研究組的科研成果，以Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases為題，在線發表在Nature Medicine上。該研究將Dre-rox同源重組系統引入到傳統的基於Cre-loxP同源重組系統的遺傳譜系示蹤技術中，有效地規避了由於Cre表達的不特異性而導致的非特異性（「異位」）同源重組，實現了更為精準的遺傳譜系示蹤，為發育、幹細胞及再生等領域的深入研究奠定了可靠的技術基礎。
遺傳譜系示蹤技術是揭示特定類型細胞在發育、疾病和再生中轉分化現象的有效研究方法，目前，體內的細胞追蹤技術主要基於Cre-loxP同源重組系統。在含有Cre的轉基因小鼠中，Cre由於在特性基因的啟動子驅動下，表達在特定的細胞類群中，當Cre小鼠與含有loxP位點的報告基因小鼠交配時，Cre通過識別loxP位點，將兩個loxP位點之間的終止序列切除，從而使含有Cre的細胞類群表達出報告基因，由於這種切除是位於基因上的，從而是永久性的和不可逆的，因此，所有表達Cre的細胞類群及其後代（無論是否表達 Cre）都將永久的被報告基因蛋白標記上，因此，利用該細胞追蹤技術可以解析特定細胞的起源和命運。
儘管基於Cre-loxP系統的遺傳譜系示蹤技術是研究發育、疾病、再生等過程細胞命運可塑性的強大利器，但它本身也存在技術瓶頸。該技術的準確性主要依賴於Cre表達的特異性，如果有微量的Cre表達在了非靶向細胞中即為所謂的異位表達，那麼譜系示蹤結果的可靠性將降低，而這也成為近年來很多科學問題出現爭議的主要原因之一。
為了解決這一技術瓶頸，周斌研究組開發了一種新的譜系示蹤技術，稱為DeaLT（Dual-recombinase-activated lineage tracing），該技術將Dre-rox同源重組系統與傳統的Cre-loxP同源重組系統結合，Dre-rox介導的同源重組反應在可能引起Cre異位表達的細胞中將Cre重組酶的識別位點loxP切除掉，有效地阻止Cre-loxP的異位同源重組，增加Cre-loxP介導的譜系示蹤結果的準確性。該系統包含兩種策略，分別是DeaLT-IR和DeaLT-NR。DeaLT-IR策略的報告基因小鼠上包含的兩個loxP位點和兩個rox位點以交錯形式存在（loxP-rox-loxP-rox），該策略適合組成性Dre與誘導性Cre相結合；而DeaLT-NR策略報告基因小鼠上的loxP位點和rox位點以嵌合的形式存在（rox-loxP-loxP-rox），該策略適合誘導性Dre和誘導性Cre相結合。
系統創建後，周斌研究組首先利用DeaLT-IR策略解決成體心臟c-Kit+心臟幹細胞的問題。成體c-Kit+幹細胞是否能夠分化形成心肌細胞之所以存在爭議，主要由於c-Kit除了表達在非心肌細胞中以外，本身還微量地表達在心肌細胞中，傳統的示蹤技術利用Kit-CreER無法做到單純示蹤c-Kit+幹細胞，而利用新開發的DeaLT系統阻斷了心肌細胞中Kit-CreER的同源重組反應，實現非心肌細胞中c-Kit+幹細胞特異性的遺傳譜系示蹤。結果發現，c-Kit+幹細胞在成體心臟生理穩態和損傷修復過程中均不會分化形成心肌細胞，主要是通過血管新生參與心臟修復。此外，利用DeaLT-NR系統解決了肝臟領域有關Sox9+肝組細胞能否轉分化形成肝細胞的爭議問題，造成該爭議的原因是Sox9除了表達在膽管上皮細胞中還少量的表達在膽管周圍的肝細胞裡面，傳統的譜系示蹤技術利用Sox9-CreER標記了膽管上皮細胞和膽管周圍的一部分肝細胞，因此很難判斷損傷後Sox9-CreER標記的新生成的肝細胞到底來自哪一部分。DeaLT技術阻斷Sox9-CreER在肝細胞中的同源重組反應，實現Sox9+膽管上皮細胞中特異性的遺傳譜系示蹤，結果發現在肝臟生理穩態和損傷修復過程中Sox9+膽管上皮細胞並不會轉分化形成肝細胞。DeaLT策略不僅提供更精確的Cre重組酶的控制，並為Cre表達細胞的譜系追蹤設定更高的技術標準，但它也足夠靈敏以檢測體內譜系轉換事件。以肝損傷後肝細胞轉分化形成膽管上皮細胞為例，DeaLT策略能清楚地展現肝損傷後肝細胞能夠轉分化形成膽管上皮細胞的過程。因此，這種新策略可用於揭示細胞命運轉變，也嚴格控制潛在的非靶向細胞表達Cre介導的異位譜系追蹤，為多個研究領域更準確地解析細胞起源和命運提供了有效手段。
研究工作得到了中科院、基金委、科技部以及上海科委等的支持。 (生物谷Bioon.com）