5年前，不懂基因編輯的神經生物學周海波博士偶然遇到熟悉基因編輯但是不懂神經生物學的楊輝研究員，這期間他們之間能碰撞出什麼絢爛的火花？如果說，2018年他們合作發表在Nature Neuroscience上的工作（在腦內實現多個基因的同時激活並且能夠將腦內的星形膠質細胞轉化為神經元）只是牛刀小試，那麼今日在Cell上在線發表的這項工作可謂是一場華麗的升級。這項成果運用最新CasRx系統特異性地在視網膜穆勒膠質細胞中敲低Ptbp1基因的表達，首次在成體中實現了視神經節細胞的再生，並且恢復了永久性視力損傷模型小鼠的視力。同時，該研究還證明了這項技術可以非常高效且特異地將紋狀體內的星形膠質細胞轉分化成多巴胺神經元，並且基本消除了帕金森疾病的症狀。該工作稱得上是神經生物學領域一項重大突破，給今後臨床上治療相關疾病奠定了堅實的基礎。
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責編 | 迦漵
點評丨薛願超（中科院生物物理所研究員）
人類的神經系統包含成百上千種不同類型的神經元細胞。在成熟的神經系統中，神經元一般不會再生，一旦死亡，就是永久性的（BioArt註：成熟的神經系統中神經再生領域目前也有一些爭議，參見此前BioArt的報導：Cell Stem Cell聚焦爭議 | 老年或疾病狀態下，人類大腦海馬仍然存在神經再生；Nat Med | 90歲高齡，大腦中還存在神經再生？神經再生又上演「神仙打架」）。
神經元的死亡會導致不同的神經退行性疾病，常見的有阿爾茲海默症（Alzheimer disease，AD）和帕金森症（Parkinson’s disease，PD）。此類疾病的病因尚不明確且沒有根治的方法，因此對人類的健康造成巨大威脅。據統計，目前全球大約有1億多的人患有神經退行性疾病，而且隨著老齡化的加劇，神經退行性疾病患者數量也將逐漸增多。在常見的神經性疾病中，視神經節細胞死亡導致的永久性失明和多巴胺神經元死亡導致的帕金森疾病是尤為特殊的兩類，它們都是由於特殊類型的神經元死亡導致。
我們之所以能看到外界絢爛多彩的世界，是因為我們的眼睛和大腦中存在一套完整的視覺通路，而連接眼睛和大腦的神經元就是視神經節細胞。作為眼睛和大腦的唯一一座橋梁，視神經節細胞對外界的不良刺激非常敏感。研究發現很多眼疾都可以導致視神經節細胞的死亡，急性的如缺血性視網膜病，慢性的如青光眼。視神經節細胞一旦死亡就會導致永久性失明。
據統計，僅青光眼致盲的人數在全球就超過一千萬人。帕金森疾病是一種常見的老年神經退行性疾病。它的發生是由於腦內黑質區域中一種叫做多巴胺神經元的死亡，從而導致黑質多巴胺神經元不能通過黑質-紋狀體通路將多巴胺運輸到大腦的另一個區域紋狀體。目前，全球有將近一千萬人患有此病，我國尤為嚴重，佔了大約一半的病人。如何在成體中再生出以上兩種特異類型的神經元，一直是全世界眾多科學家努力的方向。
CRISPR/Cas9介導基因編輯技術自從問世以來，已經在各個研究領域得到了非常廣泛的應用。由於CRSIPR/Cas9是直接對DNA進行永久性修改並且具有潛在的脫靶效應，在臨床應用中，可能會產生巨大的安全隱患。最近幾年，以Cas13家族為代表的RNA靶向基因編輯技術被發展出來，其中以CasRx（RfxCas13d）尤為受到關注與重視【1】。
在不觸動DNA的前提下，這項技術就可以對目標基因的表達實現非常強的抑制效果，值得一提的是2020年3月18日，上海科技大學黃鵬羽實驗室與中科院神經科學研究所楊輝實驗室合作，在Protein & Cell雜誌發表研究論文，首次利用Cas13d家族蛋白CasRx在小鼠肝臟中實現了基因的高效沉默，從而證實Cas13d系統在成體動物體內也具有靶向沉默RNA的活性【2】。相對於Cas9，Cas13家族蛋白比較小，很容易被包裝進AAV中，而且非常特異，在RNA水平上極少產生脫靶效應，讓其在安全性以及潛在的疾病治療上擁有了巨大的優勢。
2020年4月8日，來自中國科學院腦智卓越中心（中國科學院神經科學研究所）的楊輝團隊在Cell上發表了題為Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice的文章。本項研究在楊輝研究員和博士後周海波的共同指導下完成。
該項研究通過運用最新開發的RNA靶向CRISPR系統CasRx特異性地在視網膜穆勒膠質細胞中敲低Ptbp1基因的表達，首次在成體中實現了視神經節細胞的再生，並且恢復了永久性視力損傷模型小鼠的視力。
同時，該研究還證明了這項技術可以非常高效且特異地將紋狀體內的星形膠質細胞轉分化成多巴胺神經元，並且基本消除了帕金森疾病的症狀。該研究將為未來根治以上兩種嚴重的神經退行性疾病提供了可能，同時也為眾多神經退行性疾病的治療提供一個新的途徑。
該研究中，研究人員首先在體外細胞系中篩選了高效抑制Ptbp1（BioArt註：2013年UCSD的付向東教授實驗室在Cell報導了單獨敲低Ptbp1可以在體外實現將小鼠成纖維細胞轉分化為功能性神經元，第一作者薛願超博士現為中科院生物物理所研究員【3】）表達的gRNA，設計了特異性標記穆勒膠質細胞和在穆勒膠質細胞中表達CasRx的系統。所有元件以雙質粒系統的形式被包裝在AAV中並且通過視網膜下注射，特異性地在成年小鼠的穆勒膠質細胞中下調Ptbp1基因的表達。
大約一個月後，研究人員在視網膜視神經節細胞層發現了由穆勒膠質細胞轉分化而來的視神經節細胞，並且轉分化而來的視神經節細胞可以像正常的細胞那樣對光刺激產生相應的電信號。研究人員進一步發現，轉分化而來的視神經節細胞可以通過視神經和大腦中正確的腦區建立功能性的聯繫，並且將視覺信號傳輸到大腦。
在視神經節細胞損傷的小鼠模型中，研究人員發現轉分化的視神經細胞可以讓永久性視力損傷的小鼠重新建立對光的敏感性。為進一步發掘Ptbp1介導的膠質細胞向神經元轉分化的治療潛能，研究人員證明了該策略還能特異性地將紋狀體中的星形膠質細胞非常高效的轉分化為多巴胺神經元，並且證明了轉分化而來的多巴胺神經元能夠展現出和黑質中多巴胺神經元相似的特性。
在行為學測試中，研究人員發現這些轉分化而來的多巴胺神經元可以彌補黑質中缺失的多巴胺神經元的功能，從而將帕金森模型小鼠的運動障礙逆轉到接近正常小鼠的水平。
圖註：（上）CasRx通過靶向的降解Ptbp1 mRNA從而實現Ptbp1基因表達的下調。（中）視網膜下注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1可以特異性的將視網膜穆勒膠質細胞轉分化為視神經節細胞，轉分化而來視神經節細胞可以和正確的腦區建立功能性的聯繫，並且提高永久性視力損傷模型小鼠的視力。（下）在紋狀體中注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1可以特異性的將星形膠質細胞轉分化為多巴胺神經元，從而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的運動症狀。
據了解，該工作在投稿Cell雜誌期間得到了審稿人的高度評價，審稿人認為
「如何利用RNA靶向CRISPR系統來達到治療的目的，這項研究給出了一個優雅和令人振奮的例子（This manuscript presents an elegant and exciting example of using RNA-targeting CRISPR systems for therapeutic purposes）」，
「以往的研究都集中在利用RNA靶向CRISPR系統來直接降低遺傳病模型中有害的突變轉錄本，而這項研究卻利用這些工具在體內進行治療性的細胞命運轉分化，從而展現一個全新的視角，這是非常有意思的，而且可以得到廣泛的應用」
（previous efforts of RNA-targeting CRISPR systems focused on knockdown of toxic mutant transcripts in models of mendelian inherited genetic disease, whereas this study presents the novel aspect of using these tools for in vivo therapeutic cell fate conversion, which is quite interesting and could be a broadly applicable approach）。
需要指出的是，雖然科學家們在實驗室裡取得了重要進展，但是要將研究成果真正應用於人類疾病的治療，還有很多工作要做，未來還需要進一步在非人靈長類動物身上進行進一步研究。人類的視神經節細胞能否再生？帕金森患者是否能通過該方法被治癒？這些問題有待全世界的科研工作者共同努力去尋找答案。
總的來說，這是一項極其有價值而且重要的工作，為未來眾多神經退行性急性的治療提供了非常有前景的治療方案。
腦智卓越中心博士後周海波、助理研究員蘇錦霖、博士研究生胡新德、周昌陽、李賀、陳昭融為論文共同第一作者。中科院腦智卓越中心楊輝研究員和周海波博士為本文的共同通訊作者。同時，研究團隊特別的感謝腦智卓越中心學術主任蒲慕明院士以及智卓越中心徐華泰研究員、張翼鳳研究員、姚海珊研究員和周嘉偉研究員對該項研究的大力協助。
團隊主要作者：從左到右依次為蘇錦霖，楊輝，周海波；右上：胡新德，右下：周昌陽。
參考文獻
1、Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N. J., Oki, J., Shokhirev, M. N., & Hsu, P. D. (2018). Transcriptome engineering with RNA-targeting type VI-D CRISPR effectors.Cell, 173(3), 665-676.
2、He, B., Peng, W., Huang, J., Zhang, H., Zhou, Y., Yang, X., ...Yang, H. & Peng, H. (2020). Modulation of metabolic functions through Cas13d-mediated gene knockdown in liver.Protein & Cell, 1-7.
3、Xue, Y., Ouyang, K., Huang, J., Zhou, Y., Ouyang, H., Li, H., ... & Fu, X. (2013). Direct conversion of fibroblasts to neurons by reprogramming PTB-regulated microRNA circuits.Cell, 152(1-2), 82-96.
專家點評
薛願超（中科院生物物理研究所研究員）
神經元結構或功能的喪失是神經退行性疾病發生的根本原因。在體內，尤其是原位再生神經元並重建神經環路，將有望治療由於神經細胞損傷所導致的退行性病變，如帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病和神經性失明等。
我在UCSD付向東教授實驗室進行博士後研究工作時，意外地發現敲低RNA結合蛋白PTBP1可在體外將小鼠成纖維細胞直接轉分化為功能性神經元（Cell, 2013）。該工作發表後，我們收到了大量郵件，諮詢能否將該方法應用於神經退行性疾病的臨床治療？我清晰地記得，有位瑞典老太太從報紙上看到新聞後寫信給付老師，希望能夠在她罹患帕金森症候群的丈夫身上進行治療嘗試。
因為我當時打算回國工作，沒有延續在付老師實驗室進行PTBP1敲降治療帕金森症候群的研究，但這件事給了我巨大的震撼，也使我第一次意識到了基礎研究的價值和重要性！正如日本科學家本庶佑所講「希望國家能以長遠的眼光重視基礎研究，基礎研究本來就是一種浪費，但從這浪費之中會生出偉大的東西…」。
同樣，受到眾多患者諮詢的觸動，付老師從2013年開始即投入了大量的精力、實驗室人力和物力，著手在動物模型上攻關PTBP1敲降治療帕金森症候群的方法，經過不懈努力終於在2017年下半年在動物模型上成功實現了對帕金森症候群的治療。據悉，相關研究論文從2017年12已經開始投稿，日前剛剛在預印本雜誌BioRxiv上在線發布。
突破性的科學研究總是令人神往、欲罷不能。中國本土的科研生力軍突飛猛進。喜見Cell期刊今日發表來自中科院神經研究所楊輝課題組的研究工作，利用CRISPR-CasRx RNA編輯系統在小鼠體內敲降PTBP1後，實現了將視網膜上的Muller神經膠質細胞直接轉分化為視網膜神經節細胞（Retinal Ganglion Cells，RGC），並緩解由於RGC缺失導致的視力損失。
同時，他們利用相同的策略也在帕金森小鼠模型上實現了紋狀體原位多巴胺神經元再生，並緩解小鼠運動功能失常，證明了PTBP1敲降介導的神經細胞重編程技術在再生醫學上的應用，並為我們展現了CRISPR-CasRx RNA編輯系統在神經相關退行性病變應用中的潛力。
與細胞移植治療相比，原位再生神經元有幾大優點：1. 原位再生的神經元可直接整合進周圍的神經網絡並建立環路，避免了外源細胞移植遇到的定點存活和整合問題；2. 膠質細胞量大並且可以增殖，將一部分膠質細胞轉分化為神經元是實現神經修復的極好選擇；3.敲降PTBP1往往會抑制細胞增殖，並促進分化，這避免了幹細胞移植導致的潛在大量增殖和致癌性。
當然，任何技術都有其局限性，我認為做好以下兩點將能夠顯著縮短臨床應用的窗口期：
Cas13家族蛋白一旦被激活後往往存在附帶的RNA切割活性，未來需要更細緻的調查CasRx酶（RfxCas13d-NLS）及PTBP1-sgRNA複合物在細胞內的結合位點，以評估AAV感染細胞不同時間點後的脫靶效應程度，這對於後期臨床應用的安全性會很重要。考慮到人和鼠神經系統的區別，相同的策略在靈長類動物體內能否實現原位轉分化值得測試和期待。總之，來自楊輝課題組和付向東老師課題組的研究工作是基礎研究和臨床應用的典範，也再一次強調了基礎研究的重要性！編後記
本文的第一兼共同通訊作者周海波博士在荷蘭Erasmus University Rotterdam獲得神經科學碩士和博士學位，師從著名運動神經學家，荷蘭皇家科學院院士Chris de Zeeuw教授。一次偶然的機會認識了剛剛從MIT回國組建基因編輯實驗室的楊輝研究員。
雙方在一次簡短的交流後，意識到基因編輯技術可能會在神經性疾病治療領域大放異彩。隨即周海波在博士畢業後於2015年初回國作為博士後加入楊輝研究組，神經退行性疾病的治療作為世界性難題自然成了雙方共同攻克的方向。
其他類型細胞向神經元的轉分化一般都是通過過表達單個或者多個轉錄因子實現的，但是對於一些特殊類型神經元如多巴胺神經元的轉分化往往需要同時表達多個轉錄因子，這在體內是非常難實現的。為了攻克上述問題，他們自2015年開始研製，開發了一套高效的CRISPR激活系統SPH，這項技術可以在腦內實現多個基因的同時激活並且能夠將腦內的星形膠質細胞轉化為神經元，這項工作並於2018年1月份發表在Nature Neuroscience上。但是由於SPH載體過大，很難通過AAV導入成體並且實現神經退行性疾病的治療。
2013年，來自加州大學聖地牙哥分校付向東教授實驗室發表在Cell上的工作證明只需要簡單的敲低單個基因Ptbp1就可以在體外實現不同種類細胞向神經元的轉分化，展現了非常大的治療潛力。
同時這也是唯一有文獻報導的一個通過敲低基因表達就能實現神經元高效轉分化的靶點。所以除了基因激活，楊輝與周海波也一直在摸索能否通過基因編輯技術降低基因表達在體內實現神經元的轉分化。
最後他們決定採用RNA靶向基因編輯工具Cas13家族中最新的一個蛋白CasRx來實現對Ptbp1的抑制，CasRx不僅最小，而且相對於Cas13家族其他蛋白以及之前報導的所有抑制基因表達的技術能實現更高效更特異的抑制效果。
在研究過程中，遇到了非常多的阻礙，尤其是研究者一直無法標記誘導的視神經節細胞軸突及其在腦內的延伸，經過大量的嘗試終於通過巧妙的運用Ai9小鼠解決問題，從而證明了誘導的視神經節細胞能投射到腦內正確的區域。本項研究於2018年開始投稿，期間經歷過許多曲折，經過多輪的改進，最終投稿Cell在今年3月被接受發表。值得一提的是，周海波博士最近兩年發表了一系列相關的重要成果。除了上述的Cell和Nature Neuroscience外，其本人還是去年楊輝組Nature和最近National Science Review的共同通訊作者。
楊輝團隊的主要作者，從左依次為胡新德、蘇錦霖、楊輝、周海波
該論文的通訊作者楊輝研究員在美國麻省理工Whitehead研究所Rudolf Jaenisch課題組做博士後，主要研究方向為基因編輯與幹細胞，2014年回國擔任中國科學院神經科學研究所靈長類疾病模型研究組組長，主要主要圍繞新型基因編輯技術的脫靶安全性問題以及在動物模型的建立和疾病治療中的應用,獲得了一系列原創性成果,在Nature、Science、Nature Neuroscience、Developmental Cell、Cell Research、Protein & Cell等期刊發表通訊/共同通訊作者文章十餘篇，先後獲得「中源協和生命醫學創新突破獎」、「何梁何利科技進步獎」等，相關成果入選2019年度中國生命科學十大進展，2019年獲得國家傑出青年科學基金資助。
據楊輝研究員透露，這篇Cell文章是他建組以來最滿意、最有成就感也最感動的一個工作，解決了轉分化領域的兩個大病，治療效果都是目前報導最好的，幻想著有一天這個療法攻克各種退行性疾病。
他同時指出這才是第一步，能夠最終成藥讓病人受益才是最重要的。此項工作能夠順利完成，也說明中國科研整體環境已經有這個實力、也有這個氛圍源源不斷產出新的、好的東西。比較有意思的是，楊輝加入神經所之前不懂神經，周海波加入楊輝課題組之前不懂基因編輯。據周海波私下透露，他加入楊輝組本來只打算待幾個月的，誰知道一待就是五年，期間做出了多項重要成果。
楊輝團隊的主要成員和蒲慕明院士（前排中），後排從左依次為蘇錦霖、周昌陽、胡新德，前排左起為周海波、蒲慕明、楊輝