專家點評Cancer Cell丨 盧敏等實質性獲得靶向藥物的聖杯—— p53...

點評 |饒子和（中國科學院院士）、陳國強（中國科學院院士）、林國強（中國科學院院士）

責編丨迦漵

p53在人類癌症中突變頻率遙遙領先其餘任何蛋白（TCGA）。p53在分子生物學誕生以來被研究次數遙遙領先其餘任何蛋白（Dolgin,Nature, 2017）。p53在科學論文中被引用次數過去20年來每一年都遙遙領先其餘任何蛋白（Dolgin,Nature,2017）。p53在全球約一半癌症患者發生突變，意味著p53靶向藥物理論上可用於全球約50%的癌症患者，該群體遠高於目前臨床使用的一百多個靶向抗癌藥適用群體的總合——2-13%癌症患者（Prasad,Nature，2016；Tannock,New England Journal of Medicine, 2016）。因此，p53靶向藥物被科學界和工業界廣泛地稱為靶向領域的聖杯（至少14篇文獻稱之為「Holy Grail」）。

但獲得該聖杯需從0到1克服兩項科學難題。第一，p53是抑癌蛋白，發生突變後失去抑癌功能，因此靶向p53需要恢復（而非抑制）蛋白功能，但學術界和工業界尚無成功靶向抑癌蛋白的先例：癌症中最高頻突變的100個基因中，有51個編碼抑癌蛋白，然而臨床上一百多個靶向藥物幾乎都靶向癌蛋白，而無一靶向抑癌蛋白。靶向抑癌蛋白不僅缺乏成功先例，甚至缺乏明確的邏輯支持：化合物結合到蛋白上，有可能導致蛋白功能受到抑制（如果化合物佔據活性位點的話），但如何導致蛋白功能恢復？其邏輯是什麼？第二，p53蛋白表面光滑，沒有合適的口袋，化合物難以結合。癌症超級重磅靶點p53、PTEN、Bcl-2、KRAS、myc等等很大程度上都是因為缺乏合適的化合物結合口袋而在成藥道路上困難重重。總之，這兩項底層的科學挑戰阻礙了科學家和藥企難以獲得該聖杯：過去幾十年來，國際上至少有45個團隊報導獲得了以p53突變為治療靶點的靶向化合物，其中有17個團隊報導獲得p53功能恢復化合物，但大多數（如果不是全部的話）這些化合物的活性都難以被檢測到（Sabapathy，Nature reviews clinical oncology，2017）。

癌症中突變頻率最高的100個基因，以及臨床使用的靶向藥物

2020年12月24日，上海交通大學瑞金醫院盧敏團隊和牛津大學Xin Lu團隊（陳碩、Jia-Le Wu,Ying Liang,Yi-Gang Tang為共同第一作者）在Cancer Cell雜誌上發表了文章Arsenic Trioxide Rescues Structural p53 Mutations through a Cryptic Allosteric Site，提出了抑癌蛋白靶向理論，以及鑑定了p53功能恢復化合物三氧化二砷（ATO），提供了解決這兩個問題的範例。

該文先解決第一個科學難題：制定邏輯性p53復活理論。p53上可發生超過1000個突變，這些突變使p53功能缺失的機制有很多種，包括但不限於：發生於結構維持胺基酸上的突變，它們導致蛋白不摺疊（又叫結構型突變）；發生於DNA結合胺基酸上的突變，它們不能抑制p53摺疊，但直接導致p53不能結合DNA（又叫DNA結合型突變）等等。總之，這些突變通過不同的機制使p53不能結合DNA，進而不能發揮轉錄功能，進而失去抑癌功能。不同於以往絕大多數p53篩藥策略（基於表型進行盲篩，試圖篩到能復活所有突變型p53的全能化合物。比如已進入臨床III期的APR-246，發現者認為其既可以復活結構型突變R175H，又可以復活DNA結合型突變R273H），該研究專門針對結構型p53突變進行篩藥，其邏輯依據是：世界上可能不存在能復活所有p53突變體的「全能化合物」，既然結構型突變通過使p53不能摺疊來失活p53，那麼可以篩選能促進p53摺疊的小分子，這樣就可以邏輯性恢復這一類突變體的功能。

突變使p53失去抑癌功能的機制有多種，不太可能存在可以復活所有突變型p53的全能化合物

該文之後解決了第二個科學難題：該文發現人源p53蛋白內部含有由因為進化而形成的C124-M133-C135-C141空腔，造成人源p53三級結構不穩定。一旦維持p53結構的胺基酸發生突變（即結構型突變），蛋白將不能摺疊，進而失去抑癌功能。砷原子填補該空腔並提高p53結構穩定性，使p53發生結構型突變後仍然保持三級結構以及抑癌功能。正是這個空腔解決了p53「無口袋」這個難題。

導致p53結構不穩定的C124-M133-C135-C141空腔，剛好提供了砷結合位點

研究最終篩到了三氧化二砷（ATO）等化合物為高效的p53功能恢復化合物。對三氧化二砷的p53功能恢復效率測定表明，其在恢復p53熱力學穩定性、蛋白摺疊、轉錄活性等各項指標上，均在若干數量級上優於已報導的p53功能恢復化合物。這是首次對篩到的p53靶向化合物的工作效率進行量化測定，並將之與已報導的同類化合物進行頭對頭系統性比較的研究。（據透露，盧敏研究員在六年前回國後的不久，就篩到三氧化二砷並完成了以上工作效率的測定。但考慮到國際上至少有45個團隊曾報導獲得基於p53突變來殺死癌細胞的化合物，但又未能提供明確機制的情況下（Y220C情況特殊，不在討論之列），盧敏團隊10餘位成員又花費近6年時間完成了p53-砷共結晶結構的解析，明確了p53功能復活的機制，才開始投稿。）

三氧化二砷恢復p53蛋白摺疊能力的量化數據

在論文圖7中，研究提出了三氧化二砷只能用於治療結構突變型p53患者。在絕大部分以往報導的p53靶向化合物的研究中，研究者認為這些化合物可以復活各種各樣的p53突變體（包括進入臨床三期的APR-246），但往往只測試了對1-2個突變體的復活效果。該研究則基於結晶結構揭示的三氧化二砷工作機制，明確指出三氧化二砷只能復活結構型p53突變體，並測試了突變頻率最高的25個突變體（40%的p53突變患者含有這25個突變中的1個）進行了證實。總之，儘管全球一半癌症人口發生p53突變，砷劑靶向p53「老藥新用」具有廣闊的應用前景，但將來臨床治療或臨床試驗需精準地挑選p53突變患者，謹慎使用三氧化二砷（砒霜）。該發現獲若干底層專利簇，並進入若干歐美國家，已啟動轉化和臨床試驗。

三氧化二砷只能恢復結構突變型p53的抑癌功能

該研究最大的啟發也許不在p53蛋白本身，而在於它潛在開拓了抑癌蛋白靶向治療領域。研究提出了邏輯性恢復抑癌蛋白功能的理論並在結晶結構研究中進行了證實，並提供了化合物實例，支持抑癌蛋白有可能成藥！第二個啟發在於精準治療領域。研究首先支持了（基於基因突變的腫瘤）精準治療的必要性，此外還提出了高於當前主流的精準需求。當前主流的癌症靶向藥精準化治療主要是指「基於目標基因是否發生突變來決定是否用藥」。而三氧化二砷靶向p53不僅需要考慮p53是否突變，還需考慮是否是結構型突變，以及是否是可被三氧化二砷復活的那一類結構型突變。擬開展的不限癌種精準入組含有可以被三氧化二砷復活的p53突變患者的「籃子臨床試驗」，有可能加快讓本發現造福癌症患者。

另據BioArt了解到，該工作在投稿Cancer Cell過程中，得到了審稿人極高的評價，三位匿名審稿人都較為罕見地幾乎沒有要求補做試驗，建議論文快速發表。部分審稿意見如下：

Reviewer #1:The p53 field has been seeking a broad spectrum mutant-reactivating compound for decades and ATO shows promise in this regard.

Reviewer #2:This is a ground-breaking study and should be published asap.

Reviewer#3:ATO's ability to increase the folded state of mutant p53 is superior to any other compounds described so far.

https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.11.013

專家點評

饒子和（中國科學院院士）

小分子靶向藥物的開發是腫瘤靶向治療領域關注的核心和熱點問題。目前，靶向癌蛋白、並抑制其功能的小分子靶向藥物是腫瘤靶向治療領域的一個重要藥物門類。其中，由於激酶含有一個較深的ATP結合口袋可供化合物結合，而化合物佔據該口袋將抑制激酶的催化活性，具有兩項藥物開發的「特有便利」（有口袋、有邏輯），因此激酶成為目前腫瘤靶向治療領域關注的重點「靶分子」。

抑癌蛋白是一類由正常細胞編碼、可抑制細胞生長並具有潛在抑癌作用的蛋白，在控制細胞生長、增殖及分化過程中起著十分重要的負調節作用，當發生突變、缺失時失去抑癌功能，引起細胞惡性轉化而導致腫瘤的發生。靶向抑癌蛋白與靶向癌蛋白的藥物開發途徑截然相反，開發的靶向藥物需恢復（而不是抑制）蛋白的正常活性，以抑制腫瘤的發生、發展。然而，到目前為止，尚無靶向抑癌蛋白的小分子藥物被成功開發。主要科學問題有二，第一是抑癌蛋白缺乏合適的口袋；第二是缺乏藥物開發的「科學邏輯」，即化合物結合相對而言比較容易抑制蛋白的功能，但卻較難恢復蛋白的功能。

p53作為癌症中突變頻率遠超其餘任何一個蛋白的明星分子，其靶向藥物被領域內稱為「眾所周知的聖杯」。儘管過去幾十年已經有幾十個p53靶向化合物被報導，但這些化合物恢復p53功能的效率低下，靶向p53「無口袋、無邏輯」這兩個科學難題始終難以解決。

近日，陳碩（共同第一作者）、盧敏（共同通訊作者）在Cancer Cell上發表論文，對p53功能恢復理論、靶向p53的藥物發現進行了深入探索，提出了解決靶向p53「無口袋、無邏輯」這兩個科學難題的可能原理和途徑。一方面，他們通過p53序列和結構的分析，發現儘管p53表面缺乏一個合適的結合口袋，但p53蛋白內部的Phe、Val、Ile等強疏水大側鏈的胺基酸隨著物種進化變成了中等疏水小側鏈的Cys和Met，使人源p53分子內部形成一個相對明顯的空腔，可作為化合物的結合口袋，解決了p53「無口袋」這個難題。另一方面，p53蛋白內部形成空腔後，會造成整體結構的不穩定性增加，一旦維持p53結構的胺基酸發生突變（約30%癌症患者含有這類突變），p53蛋白將失去正確的摺疊和正確的空間結構，進而失去抑癌功能。他們發現，如果利用砷原子填補該空腔，並用三個共價鍵強有力穩定該空腔，將使p53結構異常穩定，可以在癌症相關突變發生後，依然維持p53的正確結構和功能，使之能夠繼續發揮抑癌功能，這明確了靶向p53蛋白的小分子成藥的「科學邏輯」。

該項成果在抑癌蛋白靶向治療領域的理論層次取得突破，依據於該理論發展的小分子靶向藥物已進入I/II期臨床試驗。儘管該研究解決了靶向p53時「無口袋」、「無邏輯」這兩項科學難題，但該解決方法並不一定適用於其餘抑癌蛋白，靶向其它抑癌蛋白（如PTEN、APC、RB1等）時仍將需要漫長的探索，需要通過長期「坐冷板凳」開展底層基礎研究來再次獲得突破。該研究受到國家重點研發計劃蛋白質專項資助。

專家點評

陳國強（上海交通大學，中國科學院院士）

我國學者在全反式維甲酸（ATRA）和三氧化二砷（ATO）及其聯合應用治療急性早幼粒細胞性白血病（APL）的臨床和基礎研究方面做出了重要開拓性貢獻。值得引起關注的是，在上世紀70年代哈爾濱進行的超過1000人的砷劑臨床用藥中，也初步發現砷劑可能對其它腫瘤如淋巴瘤、食管癌、慢性髓細胞性白血病等患者有一定治療效果。有關ATO治療APL外其他腫瘤的臨床試驗在最近二十年中得到廣泛開展。據統計，截止目前，在clinicaltrials.gov上登記的砷劑抗腫瘤臨床試驗超過150項，其中超過100項是在非APL型血液腫瘤和實體瘤上的「老藥新用」臨床試驗。初步臨床試驗發現ATO對肝癌【1,2】，多發性骨髓瘤【3】，MDS和CMML白血病【4-6】，難治性結直腸癌【7】也具有一定的治療效果。

然而，總體而言，ATO在非APL白血病上的臨床緩解率低。發現APL特有的PML-RAR以外的ATO作用靶點，精準選擇可能取得療效的病人，是實現ATO「老藥新用」的重要環節。近日，上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院盧敏研究員等發表在Cancer Cell上的工作揭示ATO可直接靶向結構突變型p53，促使這一類蛋白更容易摺疊並恢復其抑癌功能。該研究顯示，相比於已經報導的p53靶向化合物低下或者難以檢測的p53復活效率，ATO在復活p53效率上具有一到多個數量級上的優勢，並具明確的p53突變適用譜，即誘導p53不摺疊的那一類「結構型突變」。

ATO靶向結構突變型p53和在治癒APL時靶向PML-RARα有異曲同工之妙【8】，即它都結合靶蛋白上的胺基酸序列上距離較遠但空間位置靠近的多個半胱氨酸，都引起靶蛋白結構變化，進而誘導促癌靶蛋白「改邪歸正」。不同的是，p53作為分子生物學歷史上被研究次數和被引用次數都遙遙領先任何其餘蛋白的一個蛋白【9】，其結構型突變發生於全球20-30%癌症患者，這超過了臨床上現有上百個靶向抗癌藥可適用人群的總合（2-13%癌症患者具有這些靶向藥物可針對靶點的突變【10,11】）。這是一項少見的獲得我國自主智慧財產權的轉化型研究。據了解，基於該論文展示的數據、國際上幾十個團隊在競爭研究（發）突變型p53靶向藥物的現狀【12】、以及ATO在臨床上被證實的安全性和一定的緩解率，該發現已進入藥企轉化和臨床試驗（NCT03855371）。

專家點評

林國強（中國科學院院士）

我國在使用中藥單體治療重大疾病上做了出重要貢獻，其中包括國際公認的青蒿素衍生物治療瘧疾，三氧化二砷（ATO）治療APL白血病。這兩項成果經歷了中藥現代化道路上的漫長探索：其一是用乙醚實現青蒿素的高效萃取、在艱苦條件下測定青蒿素結構並完成全合成、青蒿素結構改造、最終實現工業化造福病人；其二是明確砷劑複方的最佳適應症、複方去汞留砷、明確ATO作用靶點PML-RARα、最終與ATRA聯用治癒了APL白血病。總之，有效成分物質化、治療機制明確化、小分子化學結構改造合理化及臨床結果清晰等為核心的中藥現代化讓這兩項偉大發現走出國門，造福全球無數患者。但中藥寶藏遠未充分挖掘，比如：經絡的物質基礎是什麼？對某些疾病已明確有治療效果的針灸的治療機制是什麼？中藥複方各個成分搭配使用的科學依據是什麼？等等，有待我們深入探索。

本期Cancer Cell上線了由瑞金醫院盧敏研究員等對中藥單體小分子ATO抗腫瘤機制的一項突破性工作。在該論文中，ATO釋放砷原子，共價結合抑癌蛋白p53內部的C124-C135-C141空腔，固定了突變型p53三級結構，並使其保留轉錄功能和抑癌功能，最終展示出依賴結構突變型p53的細胞增殖抑制能力和抗CDX及PDX腫瘤模型的能力。研究的三項亮度在於：1）癌症中一半以上的高頻突變基因編碼抑癌蛋白，但臨床使用的靶向藥物無一靶向於這類蛋白。本研究提出了基於結構穩定性的抑癌蛋白靶向理論，並通過共結晶、提供小分子化合物這兩項實例證實了這一理論靶向抑癌蛋白的可行性。2）被ATO靶向的蛋白是被稱為「基因組守衛者（guardian of the genome）」的p53。p53在全球一半癌症患者發生突變，在我國五大高發腫瘤（肺癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、肝癌）上的突變率超過40%，在卵巢癌、小細胞肺癌、肺鱗癌、食管癌、頭頸癌上的突變率超過80%。3）論文展示的數據表明，ATO對p53熱力學穩定性、蛋白摺疊、轉錄活性等各項指標上的恢復效率，均在若干數量級上，優於已報導的p53功能恢復化合物。

我國和希臘早在2000多年前就使用含砷物質治療包括腫瘤在內的各種疾病，使用砷劑治療各種非APL腫瘤的臨床試驗觀察到療效也有報導，因此中藥砷劑治療非APL腫瘤具有一定的實踐依據。然而，對能否使用ATO直接實現「老藥新用」仍需保持謹慎樂觀的態度。鑑於砷劑是眾所周知的高毒性物質，基於p53/As結晶結構進行邏輯性改造，以獲得保留p53激活活性的低毒的有機砷，或砷的複方製劑，是一個可以考慮的突破口。

參考文獻

1. Wang, H. et al. Randomized clinical control study of locoregional therapy combined with arsenic trioxide for the treatment of hepatocellular carcinoma.Cancer121, 2917-2925, doi:10.1002/cncr.29456 (2015).

3. Munshi, N. C. et al. Clinical activity of arsenic trioxide for the treatment of multiple myeloma.Leukemia16, 1835-1837, doi:10.1038/sj.leu.2402599 (2002).

4. Schiller, G. J. et al. Phase II multicenter study of arsenic trioxide in patients with myelodysplastic syndromes.Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology 24, 2456-2464, doi:10.1200/JCO.2005.03.7903 (2006).

5. Vey, N. et al. Arsenic trioxide in patients with myelodysplastic syndromes: a phase II multicenter study.Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology 24, 2465-2471, doi:10.1200/JCO.2005.03.9503 (2006).

6. Kropf, P. L. et al. Improved Survival for MDS/CMML Patients Treated with the Combination of Decitabine (DAC) and Arsenic Trioxide (ATO) in a Phase II Adaptive Three Arm Randomization Study: DAC Alone Vs. DAC +/- Carboplatin or ATO.Blood128, 3170-3170, doi:10.1182/blood.V128.22.3170.3170 (2016).

7. Podolsky, L. et al. 5-Fluorouracil/Leucovorin and arsenic trioxide for patients with refractory/relapsed colorectal carcinoma: a clinical experience.Acta oncologica50, 602-605, doi:10.3109/0284186X.2010.524934 (2011).

8. Zhang, X. W. et al. Arsenic trioxide controls the fate of the PML-RARalpha oncoprotein by directly binding PML.Science328, 240-243, doi:10.1126/science.1183424 (2010).

10. Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion.Nature537, S63, doi:10.1038/537S63a (2016).

11. Tannock, I. F. & Hickman, J. A. Limits to Personalized Cancer Medicine. The New England journal of medicine375, 1289-1294, doi:10.1056/NEJMsb1607705 (2016).

12. Sabapathy, K. & Lane, D. P. Therapeutic targeting of p53: all mutants are equal, but some mutants are more equal than others. Nature reviews.Clinical oncology15, 13-30, doi:10.1038/nrclinonc.2017.151 (2018).

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