「多肽設計」靶向MDM2-p53相互作用界面的多肽類藥物設計

2020-12-05 DrugAI

——生物學背景——

人體細胞中有眾多蛋白用以維繫生命活動的穩態，它們通過各種各樣的方式來防止癌症的發生發展。與癌症相關的重要蛋白p53在生命活動中扮演著「基因衛士」的角色。正常的p53可以通過DNA的損傷修復來維繫基因組的穩定，對於癌變的細胞，p53將會阻滯其細胞周期、促進其凋亡，以此達到抑制癌細胞的作用。p53在結構上是一個無序蛋白，N端是轉錄激活區，中間部分是DNA結合區，C端包括四聚體結構域和調控區。

圖一：p53和MDM2的相互作用機制和生理條件下的功能【1】

調節p53功能的重要蛋白MDM2是一個泛素連接酶，MDM2可以通過直接結合p53的轉錄激活區或者將其泛素化等方式來抑制p53的功能，p53調控MDM2的轉錄，即MDM2與p53之間存在著負反饋的調節通路。MDMX是MDM2的同源蛋白，它與MDM2結合後形成的異源二聚體可以增強其泛素化p53的能力。因此設計抑制MDM2與p53相互作用的藥物分子可以促進p53的激活，從而實現抑制癌症的目的。（圖一）

——發展歷程——

1996年Nikola P.Pavletich在Science上發表文章【2】，解析得到p53的N端與MDM2相互作用的晶體結構，p53蛋白N端的15個胺基酸殘基形成兩親性的α螺旋，其疏水的一面（主要有F19，W23和L26）通過疏水作用力和位阻效應結合在MDM2疏水的裂縫中。（圖二）

圖二：p53與MDM2複合物的晶體結構解析。A.yellow:p53，blue:MDM2；B.red:p53，blue:MDM2

這一結構的解析為模仿其相互作用界面，設計多肽類藥物，競爭性抑制其相互作用的藥物設計策略提供了結構基礎。並且從結構上來看，相較之靶向p53，設計模仿p53的螺旋肽來靶向MDM2更加容易一些；直接靶向p53的策略則需要有更加豐富藥物設計經驗的優秀科研工作者來完成。

2007年，Loren D.Walensky在JACS上發表文章【3】，通過模仿p53 N端的15個胺基酸殘基，設計了多肽類藥物，並在其中插入R基團為烯烴的胺基酸，通過烯烴複分解策略將多肽關環（稱作：訂書肽，stapledpeptide），進一步增強了其α螺旋，提高穩定性。通過對這一系列多肽進行活性測試，測得其中SAH-p53-8活性最好，螢光極化實驗測得其與MDM2有55nM的結合活性（圖三）。在細胞活性上，SAH-p53-8對SJSA-1 cells有8uM的抑制活性。

圖三：A.烯烴複分解策略完成環肽的合成；B.對設計的多肽進行篩選和優化

隨後Loren D. Walensky在2010年於Cancer Cell上【4】對SAH-p53-8作用機理進行了深入研究，2011年【5】解析得到了SAH-p53-8結合到Mdm2上的晶體結構（圖四）。SAH-p53-8多肽的「訂書鏈「結構與MDM2存在疏水相互作用。

圖四：SAH-p53-8與Mdm2複合物的晶體結構

2013年Tomi K. Sawyer 在PNAS發表文章【6】，將活性進一步提升，設計出靶向MDM2和MDMX雙功能的新的訂書肽——ATSP-7041（圖五）。

圖五：ATSP系列訂書肽結構及其活性

通過篩選和優化，他們發現將17位的Gln替換為Leu，21位的Asn替換為Glu，26位的亮氨酸Leu殘基的R基團改為Cba，可以增強其與MDM2的相互作用；將24位的精氨酸Arg替換為Ala可以顯著提高其溶解度；以及29、30位新增連續兩個丙氨酸Ala進行優化。最終進一步增強了其結合MDM2與MDMX的能力，分別為0.9nM和6.8nM。ATSP-7041對MCF-7 cell和SJSA-1 cells有亞微摩爾的抑制活性。

2020年南佛羅裡達大學的Jianfeng Cai教授在JMC上【7】發表文章「Rational Design of Right-Handed Heterogeneous Peptidomimetics as Inhibitors of ProteinProtein Interactions」，設計出完全非天然的多肽，抑制MDM2/MDMX與p53的結合。此多肽使用1:1 α/Sulfono-γ-AA為單體，是一種右手的413螺旋，能夠完全地抵抗酶對它的降解，提高生物可利用度。（圖六）

圖六：A.1:1 α/Sulfono-γ-AA的單體；B.C.多肽結構的側面圖和俯視圖；D.E：多肽結構的示意圖

第一輪篩選之後得到活性較好的多肽1。體外實驗測得其對MDM2和MDMX的結合常數分別為19.3nM和66.8nM。（圖七）

圖七：多肽1的結構

隨後對其側鏈使用cross-linking strategy，搭建醯胺鍵的Lactam bridge，進一步進行優化。通過細胞內的螢光極化，測得多肽14（圖八）活性最好，IC50=4.9uM。而之前的多肽1（圖七）在細胞內的螢光極化IC50=13.1uM。

圖八：A.構建cross linking的策略；B.多肽14的結構

——小結——

抑制MDM2與p53相互作用的多肽類藥物設計已經有了很多的研究，這其中有眾多的策略值得我們學習研究，例如引入非天然胺基酸以增強其與MDM2的相互作用、通過關環策略提高多肽穩定性與螺旋度、增強溶解性、提高對酶的抵抗等。這些策略或許可以應用到其它的藥物設計的體系，給予我們啟發和幫助。

參考文獻：

【1】Saadatzadeh, M. , et al. "The Role of MDM2 in Promoting Genome Stability versus Instability." International Journal of Molecular Sciences 18.10(2017):2216.

doi:10.3390/ijms18102216

【2】Kussie, Paul H., et al. "Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53 tumor suppressor transactivation domain." Science 274.5289 (1996):948-953.

doi:10.1126/science.274.5289.948

【3】Tyler, Andrew F. , et al. "Reactivation of the p53 tumor suppressor pathway by a stapled p53 peptide." Journal of the American Chemical Society 129.9(2007):2456-7.

doi:10.1021/ja0693587

【4】Bernal, Federico , et al. "A Stapled p53 Helix Overcomes HDMX-Mediated Suppression of p53." Cancer cell 18.5(2010):411-422.

doi:10.1016/j.ccr.2010.10.024

【5】Baek, Sohee , et al. "Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2." Journalof the American Chemical Society 134.1(2012):103-106.

doi:10.1021/ja2090367

【6】Chang, Yong S. , et al. "Stapled α-helical peptide drugdevelopment: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110.36(2013).

doi:10.1073/pnas.1303002110

【7】Yan Shi, et al. 」Rational Designof Right-Handed Heterogeneous Peptidomimetics as Inhibitors of Protein–Protein Interactions.」 Journal of Medicinal Chemistry 63.21(2020): 13187-13196

doi:10.1021/acs.jmedchem.0c01638

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