當羅氏的科學家Lyubomir Vassilev在2003年開始寫有關他的團隊發現了抑制p53–MDM2相互作用的小分子抑制劑的文章時，他已經預測到，這篇論文會引發熱議。因為，p53是人類癌症中突變最頻繁的基因，而他的團隊已經發現了能夠選擇性增強該腫瘤抑制因子活性的化合物。
為了紀念這一裡程碑發現，Vassilev並沒有使用難以理解的公司代碼來命名這一新化合物，而是將它們命名為nutlins，因為這類化合物是在位於新澤西州Nutley的工廠發現的。
Vassilev團隊的這項成果最終在2004年發表於Science雜誌上[1]，不僅首次讓業界了解了一個在羅氏已經運行了20多年的項目，同時，也吸引了賽諾菲、默沙東等競爭者布局p53藥物的研發。它重新激發了工業界開發調控蛋白質-蛋白質相互作用(PPIs)的潛力藥物的興趣。
2020年對nutlins來說可能是另一個具有裡程碑意義的一年，因為羅氏原定於在今年公布新一代nutlin（即idasanutlin，RG7388）針對急性髓系白血病(AML)的III期試驗數據不久後就提交監管申請。然而，在今年6月的EHAC上，羅氏宣布該III期試驗（MIRROS）失敗了。
其他公司也在靶向p53和MDM2相互作用的小分子藥物研發方面遭遇了挫折。諾華在1月份披露，公司將停止用於AML的siremadlin(HDM-201)的開發；安進已經將其臨床候選分子AMG-232授權給Kartos Therapeutics進行進一步開發。此外，在過去10年裡，強生、賽諾菲和默沙東都暫停了這方面的項目。
一些學術研究人員也正在拋棄p53。「我們實際上已經關閉了MDM2項目，因為我們認為這可能是一條死胡同。」研究MDM2靶向小分子已有十年的藥物化學家Lukasz Skalniak說。
不過，也有一些人仍在堅持，他們堅信能夠攻克這個「不可成藥」的靶點。因為，儘管小分子藥物停滯不前，但隨著訂書肽（stapled peptides）、靶向降解劑以及基於mRNA的藥物不斷發展，也許靶向p53–MDM2還有希望。
一、p53的吸引力
p53是一種複雜的蛋白質，以前一直被誤解。首次發現於1979年，因根據SDS-PAGE分析其分子質量為53 kDa被命名為p53，但它的實際質量是44 kDa。雖然研究人員最初認為它是癌症發展的致癌驅動因素，但直到後來他們才意識到p53實際上是一種強大的腫瘤抑制因子，可以抑制初生的癌細胞。在檢測到DNA損傷後，p53信號會導致細胞周期延遲，使細胞能夠修復損傷，或者在DNA損傷已經太嚴重時直接誘導細胞凋亡。
長期以來，p53一直是一個引人注目的癌症靶點。攜帶p53某些遺傳性功能缺失突變的個體，有50%的機率在30歲時患上癌症，有90%的機率在70歲時患上癌症。敲除p53的小鼠很快就會出現腫瘤。高達50%的癌症p53的兩個等位基因都發生了突變。藥物研究者推測，能夠重新激活p53腫瘤抑制能力的藥物可能具有強大的抗癌活性。
然而，相比激活蛋白，抑制它們更加容易。p53與MDM2的相互作用提供了一個關鍵途徑(圖1)。MDM2不僅可與p53結合，以阻斷其腫瘤抑制反式激活域，這一蛋白本身還是一種E3連接酶，可標記p53，使其被蛋白酶體降解。通過阻斷p53與MDM2之間的相互作用，研究者們希望，攜帶野生型p53的患者能夠恢復p53的抑癌活性。
然而，靶向蛋白質-蛋白質相互作用(PPIs)也有自己的挑戰。這種互相作用大而平的表面為配體提供了非常少的立足點，且大的蛋白質「夥伴」通常不受試圖將它們分開的小分子的影響。據曾在羅氏從事nutlins相關研究10多年的Bradford Graves回憶，到上世紀90年代末，當羅氏開始著手研究p53項目時，該公司其實已經對PPIs持悲觀態度。不過，由於MDM2的PPI界面上有一個很深的疏水性凹槽，這是一個比較明確的口袋，諾華公司已經開發出針對這種口袋的小合成肽，因此，羅氏公司將其疑慮擱置一邊。
儘管p53項目一開始進展緩慢，但Graves及其同事最終找到了「nutlins」。
Graves認為，這不僅是MDM2拮抗劑領域的重大進展，也是PPIs領域的重大進展。
MD Anderson癌症中心的腫瘤學家Michael Andreeff也認為這是一件了不起的事情。「我印象非常深刻，當我在Science雜誌上看到它時，我跳了起來。」他回憶道。
Andreeff在一次會議上遇到了Vassilev，隨後與Roche合作進行nutlins的試驗。
二、MDM2抑制劑的臨床開發
不過，儘管多年來，許多製藥公司對MDM2抑制劑進行了大量投資，但這些小分子PPI阻斷劑尚未在臨床應用。
第一個進入臨床試驗的MDM2抑制劑是羅氏的RG7112, 它是nutlin家族的優化成員。針對實體瘤和血癌的I期試驗分別在2007年和2008年啟動。Andreeff是血癌試驗的首席研究員，他對RG7112治療AML非常樂觀。因為，雖然p53在大約50%的癌症中發生突變，但僅在5%-10%的AML患者中發生突變。因為患者需要攜帶野生型p53才能獲益於MDM2抑制劑，因此，AML的這種特徵使得MDM2抑制劑更有機率有效。此外，MDM2在AML中經常過表達。
遺憾的是，在他們的試驗中，RG7112必須以非常高的劑量進行給藥，且會導致胃腸道毒性，中性粒細胞減少和血小板減少。Andreeff和他的合作者認為需要一種更有效的MDM2抑制劑。
Idasanutlin（之前稱為RG7388）擔任了這個角色。與nutlin相比，這個小分子有了不同的化學骨架。然而，idasanutlin的臨床療效也不盡如人意。
自2011年首次開展人體試驗以來，羅氏已經在不同的疾病中試驗了多種基於idasanutlin的聯合治療方案。唯一進入III期的方案是idasanutlin聯合化療藥物阿糖胞苷（cytarabine），用於治療復發或難治性AML。但是在今年6月，該試驗也因中期分析數據不佳而終止了。羅氏之前也在開發idasanutlin用於AML一線治療，但試驗也停止了。
三、聯合治療
很多人對idasanutlin的失敗並不感到驚訝，因為一些其它MDM2抑制劑也止步臨床研究。
早在2006年，研究人員就意識到，MDM2抑制劑並不總是會誘導p53野生型癌細胞凋亡，這可能是由於下遊信號通路失效所致。最初對MDM2抑制劑敏感的細胞隨著時間的推移也會產生耐藥性。
想要繼續研究p53激活劑的研究人員似乎需要找到其他策略。一種可能的解決辦法是聯合治療。
然而，與「誰」聯合呢？困難又來了。
「如果你觀察這一蛋白質的信號傳遞和相互作用途徑，它似乎與一切都有聯繫，其生物學是極其複雜的。」默沙東的高級首席科學家Anthony Partridge解釋道。
如下表所示，這些年業界已經提出了幾十種組合策略，化療、抗生素、激酶抑制劑、蛋白酶體抑制劑和治療性抗體，各種嘗試都有。一些研究已經失敗了，一些研究還在進行中。
Andreeff最喜歡的是MDM2抑制劑與阻斷BCL-2的venetoclax的結合。他2017年在Cancer Cell發表的一篇論文證實，這些藥物可以協同作用[2]。p53可驅動MCL-1降解，從而克服了對venetoclax耐藥的主要機制，而BCL-2抑制劑促進了p53驅動的細胞凋亡。
羅氏和艾伯維正在合作測試這種組合，Andreeff是研究人員之一。初步的I/II期結果顯示，緩解率為40%–50%。這項試驗正在進行中。
隨著對p53理解的不斷發展，其他策略也在興起。由於p53在腫瘤免疫中的作用（癌細胞可通過p53上調PD1和PD-L1的表達；p53的活性也會增加抑制T細胞活性的DD1α分子的表達），MDM2抑制劑作為免疫調節劑的潛力尤其受到關注。
「p53或許可以被稱為免疫系統的主要調節因子。」Andreeff說。
有幾家公司正在探索這種新的聯合方向。Boehringer Ingelheim正在測試其MDM2抑制劑BI 907282與PD-1阻斷劑BI 754091和LAG3阻斷劑BI754111的結合。諾華正在進行MDM2抑制劑siremadlin與TIM3靶向抗體MBG453聯合使用的試驗。一個學術小組正在試驗MDM2抑制劑與PD-1抗體atezolizumab的聯合使用。Ascentage Pharma（亞盛醫藥）正在進行其MDM2抑制劑APG-115聯合PD-1抗體pembrolizumab的I期試驗。
Partridge認為，整個領域都將密切關注這些免疫腫瘤學試驗的結果。如果有試驗成功，會有更多人開展同類研究。
四、訂 書 肽
MDM2小分子抑制劑失敗的另一種可能的解釋是，這些化合物可能太過專一而無法充分重新激活p53。因為，除了MDM2能夠沉默p53，與MDM2結構上相關的MDMX也可以結合併阻斷p53的活性。
愛因斯坦醫學院的細胞生物學家Ulrich Steidl認為，雙靶向途徑是成功的關鍵。
基於肽的策略目前在這方面處於領先地位。
p53有一個螺旋狀區域可以同時結合MDM2和MDMX，這個螺旋狀區域為可以結合這兩個靶點的模擬肽的設計提供了模板。雖然多肽不能很好地穿透細胞，但數十年來，研究人員一直試圖證明，螺旋狀構象的訂書肽(Stapled Peptide) 的穩定性、細胞通透性和有效性有望使其成為一種新的治療方式。
Aileron Therapeutics的ALRN-6924是臨床開發走得最快的訂書肽，該肽是MDM2和MDMX的雙重抑制劑，最初是與羅氏的研究人員合作開發的，但羅氏在2013年底退出了合作。
Steidl認為訂書肽應該得到更多的關注。在發現MDMX在AML中高度過表達後，他開始尋找可使用的MDM2和MDMX雙重抑制劑，以便進一步理解它們與p53的相互作用。
Aileron向Steidl提供了ALRN-6924。在2018年，Steidl在Science Translational Medicine報導，該訂書肽具有顯著的抗白血病作用[3]。
由於訂書肽先前曾遭受質疑，因此很多公司放棄過相關項目，而最近幾年一些公司正在重新投資訂書肽。默沙東正在與其合作夥伴一起對靶向MDM2和MDMX的訂書肽進行優化，希望最終能推動這種療法的發展。領導這項工作的Partridge說:「我認為，我們正面臨一個轉折點，一旦一些關鍵問題變得清晰，我們就可以用訂書肽認真地尋找靶點。」
五、蛋白降解劑
靶向降解劑可能提供了另一種重新激活野生型p53的方法。這種雙功能分子的一端與興趣蛋白（即靶蛋白）結合，另一端與E3泛素連接酶結合。而E3泛素連接酶可通過將一種叫做泛素的小蛋白貼在靶蛋白上將其標記為缺陷或受損蛋白。之後，細胞的蛋白粉碎機（即，26S蛋白酶體）會識別和降解被標記的靶蛋白。
nutlins在這一新興技術的發展早期扮演了一個角色。耶魯大學的Craig Crews教授和他的同事在2008年發現的第一個小分子靶向降解劑（一種PROTAC）使用nutlin招募MDM2來啟動降解級聯。
2018年發表於Cancer Research上的一項研究中[4]，Crews教授團隊描述了使用idasanutlin作為E3連接酶招募者的一種PROTAC分子，研究發現，該分子具有雙重抗癌作用機制：不僅能夠使BRD4降解，還可通過阻斷p53與MDM2的相互作用重新激活p53。
密西根大學的藥物化學家Shaomeng Wang也在用靶向降解劑重新激活p53，但方式不同。他的團隊通過將spiro-oxindole與Cereblon E3連接酶配體lenalidomide結合得到了MD-224。該分子可誘導MDM2的快速降解，重新激活p53。相關成果於2019年發表在Journal of Medicinal Chemistry上[5]。
Shaomeng Wang正在尋找機會將其MDM2靶向降解劑項目推向臨床研究。「我認為MDM2降解劑可能比MDM2抑制劑更有效。」他說。
六、mRNA療法
一些其它方法也在推動基於p53的藥物研發。比如，最近發表在Science Translational Medicine上的一篇論文中，有研究人員展示了，基於mRNA的療法可能具有治療攜帶p53突變的癌症的潛能[6]。來自哈佛醫學院Jinjun Shi及其同事使用基於納米顆粒的方法將p53 mRNA傳遞到p53缺失的癌細胞中。這導致了功能性p53在這些細胞中的表達，延緩了癌細胞的生長。當將這種方法與mTOR抑制劑everolimus聯合時，在動物疾病模型中，他們看到了顯著的抗腫瘤效果。
「p53可以說是人類癌症中最重要的靶點，所以我希望科學家們會繼續對它感興趣，並繼續應用新的方法來解決它。」 Partridge總結道。
備註：本文編譯自Nature Reviews Drug Discovery上題為「p53 programmes plough on」的報導。
參考資料：
[1]Lyubomir T. Vassilev et al. In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-Molecule Antagonists of MDM2. Science(2004).
[2] Rongqing Pan et al. Synthetic Lethality of Combined Bcl-2 Inhibition and p53 Activation in AML: Mechanisms and Superior Antileukemic Efficacy. Cancer Cell(2017).
[3]Luis A Carvajal et al. Dual inhibitionof MDMX and MDM2 as a therapeutic strategy in leukemia. Science Translational Medicine(2018).
[4]John Hines et al. MDM2-Recruiting PROTAC Offers Superior, Synergistic Antiproliferative Activity via Simultaneous Degradation of BRD4 and Stabilization of p53. Cancer Research(2018).
[5]Yangbing Li et al. Discovery of MD-224as a First-in-Class, Highly Potent and Efficacious PROTAC MDM2 Degrader Capableof Achieving Complete and Durable Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry(2020).
[6]Na Kong et al. Synthetic mRNA nanoparticle-mediated restoration of p53 tumor suppressor sensitizes p53-deficient cancers to mTOR inhibition. Science Translational Medicine(2019).
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