YEATS結構域是新近鑑定出的組蛋白賴氨酸乙醯化（Kac）和巴豆醯化（Kcr）的表觀遺傳「閱讀器」。一些研究發現，YEATS–Kac / Kcr相互作用的功能失調與人類疾病（例如癌症）的發病機制有關。2020年12月11日，李海濤課題組與李祥課題組在J. Am. Chem. Soc.在線發表題為 「Selective Targeting of AF9 YEATS Domain by Cyclopeptide Inhibitors with Preorganized Conformation」 的研究論文，報導了首個針對AF9 YEATS結構域具備高達38倍選擇性（相對ENL YEATS結構域）的環肽抑制劑，首次實現了在細胞內特異靶向內源AF9蛋白，為進一步探究二者功能異同提供了有力的研究工具，為YEATS結構域抑制劑開發提供了新的思路。
——生物學背景——
YEATS結構域是新近鑑定的表觀遺傳「閱讀器」，可通過保守的芳族「三明治」籠子識別組蛋白賴氨酸乙醯化（Kac）和巴豆醯化（Kcr）。人類基因組編碼的四個包含YEATS域的蛋白質AF9，ENL，GAS41和YEATS2存在於多種染色質重塑和組蛋白修飾複合物中，其中ENL和AF9的YEATS結構域具有很高的序列相似性。鑑於其在基因調控和染色質生物學中所起的關鍵作用，YEATS結構域被視為一類關鍵的新型表觀遺傳藥物靶點。
——研究回顧——
2016年，李海濤研究團隊首次發現AF9 YEATS結構域通過π-π-π堆積偏好性地識別組蛋白巴豆醯化的晶體結構。2018年，李海濤與李祥課題組聯合在Nature Chemical Biology首次報導了一類靶向AF9和ENL YEATS結構域的高效、特異性抑制劑，並證明其中一個選擇性靶向ENL YEATS的抑制劑具有細胞膜通透性並可以和溴域抑制劑（+）-JQ1協同作用降低白血病細胞中的相關致癌基因的表達。
在這項研究中，作者從AF9 YEATS–H3K9cr配合物晶體結構中獨特的π-π-π堆積得到啟發。在這種結構中，共軛巴豆醯基插入由兩個保守的芳族殘基F59和Y78形成的芳族「三明治」籠中（圖1a）。作者認為用擴展的π系統取代巴豆醯基可以進一步增強相互作用。因此，作者選取了組蛋白H3（殘基4-13）的十肽進行改造，將Lys 9替換為有更大共軛體系的基團，設計和合成了一系列十肽——XL-01至XL-16（圖1e）。作者在多肽上加上光交聯基團進行競爭性光交聯實驗（圖1b和1d）從而對這些十肽進行檢測，發現帶有2-呋喃羰基側鏈（XL-07，圖1e）和5-惡唑羰基側鏈（XL-13，圖1e）的兩個十肽顯示出最高的抑制能力，IC50值分別為1.3和0.74 μM。
接下來，作者朝較短的長度和較高的效力優化已開發的抑制劑。在AF9 YEATS–H3K9cr複合物中，H3 Arg8和Lys9殘基為關鍵殘基。作者合成了帶有RK籤名基序的二肽XL-07a，並向其周圍添加一個殘基，以生成另外七個抑制劑。雖然二肽活性降低，但在N端回補胺基酸能提高活性，其中QTARK序列的五肽XL-07h表現出與XL-07（十肽）相當的活性，而RK基序的C末端殘基會產生負面影響。作者採用疏水性羧基苄基（Cbz）封端五肽XL-07h的N端得到更有效的抑制劑XL-07i （IC50 = 0.26 μM，Kd = 0.33 μM）。用5-惡唑羰基取代XL-07i中的2-呋喃羰基得到了另一種抑制劑XL-13a （IC50= 0.24 μM，Kd = 0.13 μM）。
圖1
作者接著解析了AF9 YEATS結構域和五肽抑制劑XL-07i相互作用複合物的高解析度晶體結構，並且試圖將開發的抑制劑靶向其他YEATS結構域。AF9和ENL YEATS結構域之間具有高度相似性，並且ENL而非AF9通過「讀取」其YEATS結構域的組蛋白Kac標記參與了急性白血病致癌基因轉錄的調控。因此，作者用類似的手段設計了靶向ENL YEATS的抑制劑。由於ENL YEATS結構域對結合H3K27cr的親和力比H3K9cr高，作者基於K27位點周圍的胺基酸並在該賴氨酸殘基處加上了5-惡唑羰基π系統設計合成了肽。與AF9 YEATS抑制劑不同，僅帶有RK標誌基序的二肽XL-13l（IC50 =3.3 μM）顯示出比十一肽XL-13b （IC50= 6.9 μM）更好的效果。N端殘基的進一步添加得到了效果最佳的三肽XL-13m（IC50 = 0.56 μM）和四肽XL-13n（IC50 = 0.28 μM）。
由於兩種五肽抑制劑只表現出3-5倍的選擇性，而含AF9或ENL的複合物在特定基因調控事件中所起的不同作用尚不清楚。在最新的工作中，作者開發的環肽抑制劑實現了對AF9 YEATS域的選擇性抑制（選擇性最高的抑制劑JYX-3對AF9 YEATS的結合親和力比ENL YEATS高38倍）。
——實驗結果——
1、基於晶體結構發展高選擇性的環肽抑制劑
作者通過觀察此前的多肽共晶結構（AF9 YEATS–XL-07i）和組蛋白H3K27ac肽結合的ENL YEATS的晶體結構發現，儘管這兩種蛋白質的醯基賴氨酸序列結構相似性高（圖2B），但ENL YEATS表面Loop 8區域的L108和 N111側鏈與 XL-07i N 端羧基苄基(Cbz)衝突（圖2C）。相反，XL-07i的Cbz基團受到AF9 YEATS的青睞，因為它與AF9 H107和H111殘基的咪唑環形成不同的π堆積（圖2D）。值得注意的是，ENL的該區域中不存在π堆積。綜上所述，在YEATS結構域中，具有適當官能團且接近Loop 8區域的抑制劑應表現出在AF9和ENL之間的選擇性。
圖2
作者注意到，為了將其Cbz基團置於AF9 YEATS的Loop 8區，XL-07i肽採取了一種扭曲的構象用以在Gln側鏈的醯胺羰基與Arg的胍質子之間形成分子內氫鍵（圖2D）。作者認為，通過用共價鍵取代氫鍵將原始線性肽環化，可使抑制劑剛性化為AF9 YEATS有利的構型（圖2E）。根據XL-07i和XL-13a的結構，作者首先開發了四種在賴氨酸側鏈帶有呋喃或惡唑環的環肽抑制劑（JYX-1–JYX-4，表1）。去除了Gln的原始醯胺，並將烷基鏈共價連接至胍基。保留了胍，是因為它通過與AF9 D103形成電荷穩定的氫鍵而有助於YEATS與抑制劑的相互作用（圖1D）。JYX-3（IC50 = 0.41μM）和JYX-4（IC50 = 0.56μM）的效能較好。相比與AF9 YEATS，JYX-3和JYX-4對ENL YEATS的抑制活性降低了31倍和19倍，對EN9的AF9選擇性大大提高。進一步研究使抑制劑的共價鍵（JYX-5–JYX-8）多樣化，發現簡單的4碳鏈（如JYX-3）是所有測試鏈中最好的連接體。
表1
2、AF9 YEATS的Loop 8區域的結構特徵是抑制劑選擇性的基礎
觀察ENL YEATS的Loop 8，整個結構被多個分子內氫鍵牢牢穩定（圖3），這使環太硬而無法容納任何需要構象變化的外來配體。相反，AF9 YEATS的Loop 8可能更靈活，因為它僅涉及一個氫鍵。當線性肽抑制劑XL-13a接近ENL YEATS時，該肽很容易採取構象變化，以避免Cbz基團與蛋白質Loop 8之間的直接衝突。環化後，抑制劑的構象已被固定，環肽和ENL YEATS的Loop 8的剛性最終導致其結合親和力大大降低，因此，增加了環肽對AF9 YEATS的選擇性。作者對AF9和ENL YEATS結構域Loop 8處第107位及第111位這兩個關鍵胺基酸進行了突變，獲得了相對應的雙突變體AF9NN和ENLHH。等溫滴定熱法（ITC）測量表明，JYX-3對AF9 YEATS（Kd = 0.37 μM）的結合偏好是對ENL YEATS（Kd = 14.1 μM）的38倍，而相同抑制劑對AF9NN和ENLHH的Kd值分別為6.04和1.52 μM （圖3B，C）。綜上所述，Loop 8區域的Cbz-His-His單元應是JYX-3對AF9 YEATS選擇性的主要貢獻者。
圖3
3、JYX-3破壞AF9染色質結合併下調 AF9靶基因的表達
接下來作者對JYX-3開展了細胞層面的活性研究。相比於線狀抑制劑，環肽抑制劑提高了細胞通透性以及穩定性。接下來，作者驗證了JYX-3與內源性AF9的結合。細胞核提取物中的下拉實驗和活細胞內熱穩定性遷移實驗（CETSA）中，進一步揭示了JYX-3特異性地靶向細胞內源的AF9而不會作用於內源的ENL蛋白。為了評估 JYX-3抑制 AF9染色質結合的能力，作者用轉染了全長 AF9與 GFP 融合的 U2OS 細胞，進行了螢光漂白恢復實驗(FRAP)，證明了JYX-3能有有效阻止AF9與染色質的結合，而相應地對ENL卻沒有明顯作用。通過在 HeLa 細胞中進行染色質免疫沉澱和定量 PCR (ChIP-qPCR)，作者檢測到在 JYX-3處理後，MYC 和 PABPC1上 AF9和 H3K79me3的豐度減少，而 ENL 沒有減少，這表明環肽可以中斷 AF9對其靶基因的 yeats 依賴性富集，並可以進一步阻止 DOT1L 的招募。
——小結——
綜上，該論文在前期工作的紮實基礎上進行了進一步的優化，得到了針對AF9 YEATS結構域高選擇性環肽抑制劑，並闡述了環肽抑制劑高選擇性的分子機理，這離不開前期對晶體結構的認識和多肽抑制劑設計的發展。該研究提供了一種新穎的策略，可通過以醯基賴氨酸結合口袋外的另一個位點作為目標，從而實現選擇性。
參考文獻：
1. Li, Y., et al. 「Molecular Coupling of Histone Crotonylation and Active Transcription by AF9 YEATS Domain.「 Mol. Cell. 62 ,2(2016): 181–193.
DOI:10.1016/j.molcel.2016.03.028
2. Li, X., et al. 「Structure-guided development of YEATS domain inhibitors by targeting pi-pi-pi stacking.」Nat. Chem. Biol.14,12(2018): 1140–1149.
DOI:10.1038/s41589-018-0144-y
3. Jiang YX., et al.「Selective Targeting of AF9 YEATS Domain by Cyclopeptide Inhibitors with Preorganized Conformation」J. Am. Chem. Soc. 142, 51(2020):21450–21459
DOI: 10.1021/jacs.0c10324
作者：許晗宇
審稿：熊若堯
編輯：卞薇潔
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