心肌肥大是心肌細胞對各種外在和內在刺激的反應，這些刺激會增加生物力學的壓力。雖然肥厚最終能使腸壁張力正常化，但它仍能導致不利的結果，如猝死或心力衰竭【1】。研究發現，氧化應激是引起心肌肥厚尤其是腎上腺素能性肥大的一個重要原因。氧化應激是一種病理學上高水平的細胞內氧化劑，可能會推動心血管疾病的進展，這一概念已經引發了許多幹預措施的臨床試驗，如抗氧化維生素。但這並沒有降低疾病的發展和風險，部分原因可能是人們關注氧化應激的危害，卻忽視了氧化還原平衡、活性氧（ROS）和活性氮在細胞生理病理中的廣泛作用【2】。
氧化還原信號——一種對細胞內信號通路組分進行特定的、通常可逆的氧化/還原修飾的活性反應組分——在許多生理和病理過程中被認為是至關重要的【3】。而其中一個很重要的修飾就是8-氧代鳥嘌呤（8-oxoguanine，o8G）。核酸中鳥嘌呤氧化產生o8G，可以與腺嘌呤配對，誘導DNA中鳥嘌呤向胸腺嘧啶（G>T）的突變【4】，而研究發現在各種疾病發病過程中， RNA比DNA更容易產生o8G修飾。
在心臟中，氧化還原信號可以調節多種生理過程，並參與多種病理生理過程和內穩態或應激反應途徑。miRNA作為靶向mRNA的轉錄後調節因子，其氧化已被發現與細胞的氧化還原狀態相關，同時多種miRNA被證實參與了心肌肥厚發病過程。但是，迄今為止，o8G氧化修飾僅被認為是氧化損傷的結果，而其與miRNA相關的有效的表觀轉錄水平作用從未被提及，並且其是否與心肌肥大有關也未可知。
2020年8月5日，來自韓國高麗大學的Sung Wook Chi研究團隊在Nature上在線發表文章「Position-specific oxidation of miR-1 encodes cardiac hypertrophy」，在氧化還原相關的心肌肥厚動物和細胞模型中對氧化的miRNA進行了特異性測序，發現miR-1種子區域可以產生位置特異性o8G修飾，並通過o8G·A鹼基配對調控新的mRNA，從而誘導心肌肥厚的發生。由此表明miRNA的位置特異性氧化可以作為一種表觀轉錄機制來協調病理生理氧化還原所介導的基因表達。
首先，體外細胞實驗和體內小鼠模型均證實，腎上腺素能受體抑制劑（苯腎上腺素PE或異丙腎上腺素ISO）可刺激心肌肥厚的發生，促使細胞產生ROS。此外，血清飢餓（刺激腎上腺素能性心肌肥厚的前提條件）可以增強高基礎ROS水平下的心肌增大表型。而抗氧化劑N-乙醯半胱氨酸（NAC）則可以逆轉這些現象。同時，研究發現在PE處理過的大鼠心肌細胞（H9c2細胞）及原代大鼠心肌細胞（rCMC）中，小RNA尤其是20 nt大小左右的miRNA中出現了o8G修飾的富集，這比細胞中出現在大RNA中的o8G的程度更高，也遠遠高於由百草枯誘導的氧化應激所出現的o8G修飾的數量。
隨後，本文研究人員通過優化免疫沉澱技術和o8G誘導的G>T轉換，開發了一種針對miRNA中o8G的測序方法，即o8G-miSeq。將該方法應用於H9c2細胞或rCMC中，結果均顯示，miR-1b比其他miRNA更易被氧化，o8G富集程度更高，並且在PE處理後，o8G主要發生在種子區域，其中第2、3、7和15位置的o8G明顯增加（圖1 左）。而當對PE處理的rCMC進行血清飢餓時，miR-1b的第7位鹼基G成為唯一被氧化的鹼基（圖1 右），miRNA測序分析表明僅在這個位置G>T轉換增加了約2倍。
圖1o8G-miSeq分析PE處理後的rCMC（右：進行血清飢餓）
進一步的實驗證實，雖然在ISO處理的小鼠心臟中，miR-1的表達降低，但是其氧化水平是增強的。那麼發生在其種子區域的o8G（位置2、3、7，分別命名為2o8G-miR-1、3o8G-miR-1 和7o8G-miR-1）是否可使得miR-1通過o8G·A鹼基配對而識別新的靶點呢？結果是肯定的。螢光素酶報告實驗顯示o8G-miR-1可以通過同源的含氧位點使靶基因沉默，這些含氧位點可以對PE處理產生反應，並在NAC處理後反應減弱，從而表明內源性o8G-miR-1的水平足以重新靶向目的基因並實現基因沉默。當然，由於殘存的o8G·C鹼基配對活性，氧化的miR-1也能夠抑制與種子序列匹配的一些靶基因，只是抑制效果遠遠不如未被氧化的miR-1。
已知miR-1可以誘導細胞萎縮，但是本文研究人員發現PE處理可以損傷miR-1的這種作用。當向心肌細胞中導入合成的2o8G-miR-1、3o8G-miR-1 和7o8G-miR-1時，細胞表現出比PE處理後更嚴重的肥厚表型，當用鹼基U替代o8G（形成2U-miR-1、3U-miR-1和7U-miR-1）時也出現了同樣的表型，由此表明o8G對心肌肥厚的誘導是依賴於其o8G·A鹼基配對活性的。進一步的，研究發現，由7o8G-miR-1或7U-miR-1誘導產生的心肌肥厚，其細胞內心房肽ANP（一種心肌肥厚的標誌物）的表達顯著增加，隨著時間的增加，細胞逐漸增大。將合成的7o8G-miR-1或7U-miR-1通過尾靜脈注射給予小鼠後，小鼠心臟室間隔心肌細胞增大約19%，心臟增大至少10%（圖2）。同樣的，心肌細胞特異性表達7U-miR-1的轉基因小鼠也表現出類似的表型。而當特異性抑制小鼠心肌細胞中的7o8G-miR-1時，ISO誘導的心肌肥厚現象減弱。
圖2 7o8G-miR-1給藥後小鼠心臟組織切片
對o8G-miR-1給藥後的心肌細胞進行RNA測序以評估miR-1的氧化帶來的轉錄組效應，研究人員發現miR-1的o8G氧化修飾使得其重新靶向了一批新的mRNA，miR-1種子區域的氧代位點（如7氧代位點）在3』-UTR區域進化保守，使大多數基因表達下調，而這些表達下調的差異基因功能主要與心臟功能如心臟形態發生、心臟收縮和鈣離子轉運相關，並富集於心肌肥厚相關通路中。
最後，研究人員發現，o8G-miR-1也參與了其他類型心肌病的發生，在心肌病病人的心肌細胞中，miR-1種子區域的氧代位點靶向的mRNA也出現富集，例如HSPB7——先天性擴張性心肌病的風險基因——具有7氧代位點。
綜上所述，本文證明了腎上腺素能受體的激活產生ROS，導致miR-1種子區域o8G的形成（尤其是形成7o8G-miR-1），從而使得miR-1重新靶向抑制可在心肌肥厚通路中發揮作用的新靶點，進而驅動心肌肥厚和疾病的發生。也由此表明，o8G在miRNA中的形成可能是一種普遍的表觀轉錄機制，通過這種機制，ROS在病理生理條件下可以對基因表達進行微調，作為氧化還原信號的一部分，最終導致表型的改變。
原文連結：
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2586-0
來源：BioArt
參考文獻：
1. Frey, N. & Olson, E. N. Cardiac hypertrophy: the good, the bad, and the ugly.Annu. Rev. Physiol. 65, 45–79 (2003).
2. Burgoyne, J. R., Mongue-Din, H., Eaton, P. & Shah, A. M. Redox signaling in cardiac physiology and pathology.Circ. Res. 111, 1091–1106 (2012).
3. Forman HJ, Fukuto JM, Torres M. Redox signaling: thiol chemistry defines which reactive oxygen and nitrogen species can act as second messengers.Am J Physiol, Cell Physiol. 2004; 287:C246–C256.
4. Shibutani, S., Takeshita, M. & Grollman, A. P. Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG.Nature349, 431–434 (1991).