我有四倍體咖啡,你有科學故事嗎?(全長轉錄組文獻解讀-Gigascience)

多倍體化事件增加了基因組的複雜性，幫助克服極端環境，是推動植物進化的主要動力，在物種的演化過程中起了舉足輕重的作用。然而多倍體物種的轉錄組分析，長久以來受限於二代測序讀長偏短，不僅無法準確重構轉錄本，更無力探究各亞基因組間的isoform結構差異及基因如何選擇性保留。

 

自PacBio全長轉錄組測序不斷普及，以及高粱和玉米兩篇全長轉錄組文獻高調亮相Nature Communications引起廣泛關注，研究人員開始嘗試將這種新技術應用到多倍體物種的轉錄組研究中，以下是幾篇多倍體物種PacBio SMRT 全長轉錄組文獻統計，供大家參考，下載地址請點擊文末「閱讀原文」。  

【 四倍體棉花[2]的文章為未來組項目經驗，文獻解讀請戳戳~】

本次為大家解讀四倍體阿拉比卡種小粒咖啡(2n=4x=44)全長轉錄組文獻[3]，感受「全長轉錄組測序讓多倍體物種isoform重構和亞基因組phasing不再是難題」。

阿拉比卡種小粒咖啡（Coffea arabica）為世界上最為廣泛種植的咖啡品種，是由C.canephora和C.eugenioides雜交並基因組加倍形成的異源四倍體，其兩個祖先種在味道、咖啡因含量、生存環境等方面有著顯著的差別。C. arabica雖風味口感優質但對種植環境要求高、抗病蟲害能力較弱，因此研究亞基因組基因表達調控，利於培育不僅美味而且更易種植的品種。

隨機選取Coffea arabica var. K7品系的不同植株，不同部位，不同發育階段共計450 個果實。經樣本前處理、RNA提取，反轉成cDNA後，根據PacBio Iso-Seq protocol，分片段構建Pacbio RSⅡ文庫並測序。（目前新一代PacBio Sequel測序儀可構建不篩分片段的轉錄組文庫，更接近真實地還原物種轉錄本片段分布情況）

通過轉錄組注釋、同源基因比對、候選基因篩選等一系列生物信息分析，篩選出與咖啡因、蔗糖合成相關的基因的isoforms，並與相關資料庫比對。

 咖啡因合成途徑中isoform多樣性

咖啡因的合成途徑前期已有廣泛的研究，已有比較完善的資料庫提供候選基因和編碼序列信息（轉錄組和基因組數據都有），在這篇四倍體小粒咖啡的論文中，研究人員找到了10個可能與咖啡因合成相關基因的高質量isoforms，並且發現這些isoforms都發生了5'非翻譯區延伸。

Table1 咖啡因合成途徑相關候選基因注釋，isoforms及5'非翻譯區延伸情況

這10個isoforms中，有9個比基因組DNA序列長，而有一個isoform可能因為發生了可變聚腺苷酸化(APA)而短於基因組DNA序列(Fig.2 c)，在3『UTR檢測到2個潛在的APA信號(Fig.2 d)。

Fig.2 一個isoform(c25904/f2p0/977)可能因APA事件而短於基因組DNA序列

這些咖啡因合成相關的基因也存在可變剪切現象（AS），以下為DXMT2基因內含子保留AS示例(Fig.3)。

Fig.3 DXMT2基因內含子保留AS示例

異源四倍體小粒咖啡轉錄組的isoforms表現出較明顯不同的亞基因組來源，通過與已發表的祖先種之一C. canephora的轉錄組數據進行比對，XMT1、MXMT1、DXMT2基因的isoforms與C. canephora的isoforms有較好的一致關係，表示這些isoforms可能來源於C. canephora亞基因組；相反，XMT2、MXMT2、DXMT1與C. canephora的isoforms比對率不高，表明他們可能來源於另一個C.eugenioides亞基因組。

通過重構isoform初探複雜多倍體亞基因組的基因表達

通過PacBio 全長轉錄組測序，可準確地重構小粒咖啡的轉錄本信息，以蔗糖合成途徑中非常重要的基因SS1為例，研究人員發現了9個轉錄本異構體，包括替換、缺失、內含子保留等多種可變剪接形式。

Fig.4 蔗糖合成相關基因SS1多種可變剪接形式

隨後，同樣通過與祖先種之一C. canephora的轉錄組數據進行比對，分析比對率和相同的核苷酸變異（Fig.5），以此推斷單個isoform來源於哪個亞基因組。例如Fig.5中第1行（標黃）為祖先種之一C. canephora SS1基因序列，將小粒咖啡的多個isoforms的一致性序列與其進行比對，第2-5行的isoforms與C. canephora表現出高度的一致性，並共同在3,726 bp處有一個A-G的鹼基替換，與第6-10行相比，在3,707bp、3,733bp處有著同樣的inset、在3,713bp、3,715bp處有著同樣的鹼基替換，以此將isoforms的來源區分開。

 Fig.5 SS1基因多個isoforms一致性序列中的鹼基變異比較

第二個有力的證據是，第6-10行的isoforms與C. canephora相比較，在內含子10區域，有著更高的變異。

另外還可以通過等位基因加以佐證。

可變剪接、可變聚腺苷酸化、5』UTR延伸、亞基因組拷貝數這些因素的綜合作用，形成了轉錄本的多樣性，本文以咖啡和蔗糖合成途徑相關基因為例，以PacBio SMRT長讀長測序為技術手段，完成四倍體小粒咖啡 isoforms重構和亞基因組複雜、多樣的基因表達研究，為其它多倍體物種基因表達調控研究提供參考。

未來組憑藉率先引進PacBio Sequel平臺的優勢，已完成十餘個多倍體動植物轉錄組測序分析，在多倍體物種isoforms重構和亞基因組phasing方面經驗豐富，如需要詳細了解，請垂詢當地科技顧問或在後臺留言。

引用文獻

[1]Clavijo B J, Venturini L, Schudoma C, et al. An improved assembly and annotation of the allohexaploid wheat genome identifies complete families of agronomic genes and provides genomic evidence for chromosomal translocations[J]. Genome research, 2017, 27(5): 885-896.

[2]Wang M, Wang P, Liang F, et al. A global survey of alternative splicing in allopolyploid cotton: landscape, complexity and regulation[J]. New Phytologist, 2017.

[3]Cheng B, Furtado A, Henry R J. Long-read sequencing of the coffee bean transcriptome reveals the diversity of full-length transcripts[J]. GigaScience, 2017.

[4]Hoang N V, Furtado A, Mason P J, et al. A survey of the complex transcriptome from the highly polyploid sugarcane genome using full-length isoform sequencing and de novo assembly from short read sequencing[J]. BMC genomics, 2017, 18(1): 395.

[5]Luo Y, Ding N, Shi X, et al. Generation And Comparative Analysis Of Full-Length Transcriptomes In Sweetpotato And Its Putative Ancestor[J]. bioRxiv, 2017: 112425.

文案：李贇

編輯：張芳芳

圖片來源於網絡｜侵刪

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