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還講轉錄組
目前轉錄組的定量和差異分析，網絡上、培訓課上資料都非常多，方法也比較固定，但是目前我們分析碰到的最常見問題，就是同樣的數據，用不同的軟體找到的差異基因差異很大，並且很多時候找不到我們想研究的功能基因，同時很多基因在不同樣品間的表達並不穩定。因為傳統的分析方法和原理有著天生的局限性，沒能充分地發揮轉錄組測序數據的潛力。所以對於很多生信老鳥和菜鳥來說，轉錄組的定量和差異分析，還點玄學的感覺。
我們這裡介紹一種新的定量方法（RNADX），它在qPCR的原理上進行了升級，能大大地提高轉錄組定量的準確性，特別適合高雜合的昆蟲、海洋生物和林木，並且能在已發表的數據中找到一些新的差異基因。
RNADX
這是一套改進的RNA高通量測序實驗和分析方法，它通過表達穩定的外參基因來對其他基因進行定量，能大大提高樣品間基因定量的穩定性，同時qPCR的驗證率也有20%以上的提高。
基因定量
基因的定量，就是基因在特定時期的表達水平。那麼怎麼定義基因的表達水平呢？在回答這個問題之前，我先問1個初中的物理問題：怎麼定義一個物體的重量呢？性感男神如花跟我比，哪個更重？
為了解決這個問題，國際上制定了1千克的標準品，然後又以這個標準品的重量為基準，製造了很多重量與標準品相同的砝碼，送給了不同的國家機構，然後這些機構，就以標準品為基礎，製造了2千克，5千克，100千克等砝碼，用來測量物體的重量。假如目前如花測量的體重是90千克，我本人測量的體重是65千克，那麼如花就比我重25千克，體重是我的1.38倍。
那麼回到剛才的問題，我們怎麼定義基因的表達水平呢？那麼我們也要找一個標準基因，用來衡量其他基因的表達。我們管這個標準基因叫內參基因，理論上它在各時期表達都要很穩定。在我們的實驗室裡，大家用一種叫qPCR的方法，將基因和內參基因做比較，得到的差異倍數，作為這個基因的表達水平。示意圖如下：
傳統的qPCR方法，會用一些表達穩定的內參基因（referencegene）作為標準，用其他基因的表達與標準內參作比較，得到基因的表達，如下圖所示：
高通量測序
因為上述的qPCR實驗方法太費人力，所以現在很多實驗室採用測序的方法來測量基因的表達。但是測序方法跟我們的qPCR方法不一樣，怎麼定義基因的表達，目前國際上還一直爭論不休，一直提出新的統計方法(RPKM，FPKM, TPM，CPM等)，讓人眼花撩亂，但是這些基因表達的統計方法，是基於一個這樣的概念：基因的表達在整體表達中佔的比重，示意圖如下：
尷尬的困境
我們做的轉錄組定量，是想要知道在不同的實驗環境下，哪些基因的表達產生了變化。但是當我們拿到測序結果後，用不同的軟體和統計模型，總會發現它們找到差異基因差別還是挺大的，跟我們的qPCR實驗吻合度也不高，只有30%-50%。
為什麼高通量測序和傳統的qPCR定量，這兩種方法的結果差別會這麼大呢？因為有些的基因，在不同的實驗條件下，表達水平相差特別大，大到能影響整體。比如村裡來了一位姓馬的鄉村教師傑克，而且他還把他的所有錢都帶過來了，村裡的總資產被大大拉高了，其他村民資產佔的比例就降低了。以下我們舉個極端的例子，就能一目了然的知道問題所在了：
走出困境
從上面的例子可以看出，只要我們的不同樣品間，有表達穩定的內參基因，所有基因與這個內參基因比較，不就能得到準確的定量結果嗎？老哥也在科研路上混了10來年，有這個想法的牛人應該不計其數，如果可行，國際上應該有文章發表才對，但是為什麼現在主流的高通量方法，還是用基因的表達比例來計算呢？因為所謂的內參基因，在某些期期表達也不穩定，甚至不表達。
即然內參不靠譜，能不能加入表達穩定的外參序列作為標準基因？如果你想到這方面，說明你跟我一樣，開始步入U秀的行列了，目前國際上還真的有這種標準品，叫ERCC Spike-In，它目前是被用到表達譜晶片上，用來校正基因的表達。
在高通量測序上，目前是被用來評價實驗的一致性。那麼為什麼很少聽到有人用它來校正基因的表達呢？主要是因為要用它來作為內參，它就必須是非常精確的標準品，每mL的水裡，要有多少個外參序列，都是非常研格限制的，所以這個標準品很貴。另外就是在做實驗的時候，要同時嚴格地控制RNA量和標準品量的比例，對實驗人員要求也非常高。作為一名曾經放蕩不羈愛自由的科學工作者，開了公司接了些轉錄組項目，得想辦法克服這些問題，不能砸了招牌，沒有條件，就要創造條件。在這個過程中，我也深深體會到中國科研人員的無奈和公司的機智。
首先要解決標準品昂貴的問題，它除了實驗技術要求高之外，最大的問題是很多公司不願意投入研發，因為現在高通量轉錄組基本沒有利潤，如果客戶分析結果不好，還可以讓客戶再測一次，多收一份錢，雖然很大可能結果還是一樣不好。可能是本人的運氣比較好吧，杭州的一家試劑公司，叫開泰生物，投入了不少人力，幫我們設計併合成了標準品。
然後就要解決實驗操作問題，因為不同批次的樣品，不可能每次加內參的比例都一樣，存在人為誤差，即然實驗解決不了，我們就從算法上解決，我們可以通過樣品基因表達的整體差異倍數，來糾正標準品的誤差，從而做到精準定量。在這裡，非常感謝在美國的宋教授和他的團隊，幫我們開發了一個叫RNADX的軟體（等文章發表後我們會把它放到github上）。
方法介紹
我們在建庫的時候，加入了表達穩定的人工外參序列，然後進行高通量測序。在測序完成後，將不同的基因與外參序進行比較，得到相對定量，如下圖所示：
A. RNA建庫，將去除核糖體RNA後的RNA文庫，加入1%的人工外參序列。
B. 基因定量，把所有的基因與外參序列進行比較，得到基因的相對定量，找到差異基因。
效果評估
為了評估我們的算法準確度，我們用了植物基因組，動物基因組，還有糖尿病小鼠來做評估，評估指標如下：
相關係數
我們使用corrplot這個R包來對樣品的相關性進行計算，樣品間的相關係數越高，說明樣品間的基因表達相似度越高，找到的差異基因越精確。通常情況下，組內的相關係數要比組間的相關係數高，組內的相關係數最好大於0.9，組間大於0.7。
•動物樣品
這是一組雌雄個體RNA的數據比較，我們可以看出用了RNADX的定量，能大幅提升組間樣品相關性，平均從0.5提成到0.7。在FPKM組內相關性很好的情況下，RNADX算法也能提升一點。
• 植物樣品
我們只對這株植物的根、莖、葉、花蕾、果實進行測序，我們的RNADX方法，都比FPKM的方法樣品間的相關係數要高出不少，大概能有10%的提升。
qPCR驗證
目前來說qPCR是基因定量的精標準，所以我們挑了小鼠的基因來進行驗證，拿RNADX的結果和目前文獻裡最常用的方法來進行比較。
• 小鼠轉錄組
因為哺乳動物的RNA相關係數相對都很高，我們直接用qPCR的方法，來驗證我們數據的準確度。綠色的是qPCR的結果，作為標準。紅色是RNADX的結果，灰色則是我們大部分文獻裡用的edgeR包做的差異分析。
我們挑選了qPCR表達為上升趨勢的基因，來驗證不同的定量方法，RNADX方法中，只有一個基因差異倍數小於1，其他的差異倍數都大於1，為上升趨勢。而edgeR這個軟體，3個基因被過濾掉了，並且1個基因的pvalue>0.05，差異倍數也不明顯。
定量比較
為了顯示RNADX的方法比FPKM優秀，我們挑了兩個FPKM值非常不穩定的基因，再看看RNADX的表達，表格如下：
上表中我們可以看出FPKM的表達，誤差比較大，而且很多樣品的表達為0，而RNADX的數字穩定得多。
為了直觀地展示，我們對上表作了個圖，如下所示：
PS：為什麼FPKM很多樣品表達為0，而RNADX的表達不為0，那是因為我們使用hisat2比對軟體和stringtie來計算FPKM，而我們的RNADX方法則有自己的比對處理模塊，使得比對結果更加真實。
提供服務
1.外參試劑，用戶可以在構建文庫的時候，根據逆轉錄cDNA的濃度進行1:99比例添加。
2.實驗外包，用戶可以把提好的RNA或者樣品送寄來我們公司，我們對樣品進行建庫和測序。
3.數據分析，我們提供基因定量，新轉錄本構建，功能注釋，差異分析，可變剪切分析，並提供一份結題報告。
4. 算法源碼，因為我們正在對這個方法進行文章撰寫，暫時就不提供源碼了，但是可以提供一個收費的可視化的平臺。
常見問題
1. 我們幹嗎要用這個新方法？
我們這個方法的目標群體是對數據準確度有追求，並且已經有想研究的基因的科研人員，因為他們要研究的基因就鎖定在一個小範圍內，需要的定量結果要經得起考驗。
2. 我們已前測了好多轉錄組數據了，但是沒有加外參，可以用這個方法進行分析嗎？
應該可以，但是有些樣品的內參基因表達不穩定，會被過濾掉。
我們的軟體會自動在樣品間查到內參基因，用內參基因來對樣品進行歸一化。但是有些樣品的內參基因表達不穩定，我們的軟體會自動過濾掉這些樣品，這些樣品就沒法用來分析了。樣品越多，它們的共有內參基因就越少，根據我們的經驗，9個樣品以內，這個算法的效果還是可以的。
3. 目前有些公司，推出了「絕對定量」轉錄組，就是每條RNA加了分子標籤（UMI），RNADX方法跟它比怎麼樣？我們要解決的問題是基因定量，也就是數據歸一化的問題。加了UMI的轉錄組可以解決實驗上某些RNA分子擴增過量造成的問題，但是如果分析人員最後還是用傳統方法或者軟體來定量分析，那所謂的「絕對定量」轉錄組，也只是某些公司的噱頭，起的只有錦上添花的作用。
4. 你們提供的服務收費嗎？
嗯，收費。因為外參測劑合成的成本比較高，另外操作要求非常高，所以收費會比較高。
5. 你們把分析原理寫出來，不怕別人抄襲嗎？
這個加內參或外參的分析方法，在十幾年前就有人發表過文章了，現在還有ERCC的外參試劑賣。只是算法和實驗沒有相結合。另外很多事情看上去是挺簡單的，但是做起來可沒那麼簡單。別拿你的業餘愛好跟我們這些靠技術吃飯的人來比較。
6. 你們的評估效果看上去很不錯，是不是吹牛呀？
沒有吹牛，有時候太過優秀也會招人嫉恨。
7. 你們文章沒發表前，我們用了你們的方法，在文章裡怎麼提你們的技術？
我們會提供一個可視化的galaxy平臺在github上公布，不過需要付費使用。
收費標準
市場指導價：外參:800+提取:150+建庫:500+測序:360+分析:500=2310。
具體價格可聯繫當地銷售。
產品比較
優惠方案
本次是我們第一次進行正式推廣，在2020年5月1日前，我們有以下優惠政策。
1. 分析效果不能優於傳統方法（評價指標為相關係數，表達異常值的數量），我們承擔一半費用。
2. 我們提供舊數據分析服務，最高可打7折，效果不能優於傳統方法則不收費。
3. 轉發本文章，併集齊10個贊，進行朋友圈截圖，可再打9.5折。
4. 15個樣品實驗+分析，送ipad mini。
聯繫我們
我們提供了以下QQ群，裡面有幾位資深分析人員（平均每人在Nature子刊上發表過10篇以上論文），看心情為你解答轉錄組或者人生問題（申請時備註：單位+研究方向，本群除了群主，其他人嚴禁發廣告）。
另外本公司目前招聘NGS的信息分析人員和產品經理，有意向的可以加群後私信群主。
各地區代理商
持續更新中，有意向公司請聯繫群主：
• 杭州開泰生物
• 武漢大眾源生
參考文獻
[1]Evaluation of the External RNAControls Consortium (ERCC) reference material using a modified Latin squaredesign.
[2]Measurement of mRNA abundance usingRNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.