全自動固相萃取-高效液相色譜法串聯質譜測定 水中沙星類抗生素...

2020-11-29 儀器信息網

1.介紹

沙星類（Quinones，QNs）抗生素（圖-1）是一類人工合成的新型殺菌性抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性以及毒副作用小、價格低廉等特點，被大量用於治療和預防水生動物疾病及促生長。但研究表明，所使用的抗生素僅20%～30%被魚類吸收，大部分進入環境中，而這部分抗生素再次進入食物鏈，可能導致養殖環境中病菌耐藥性的產生，導致二次汙染。這不僅影響到水產養殖業的健康發展，而且還威脅著生態環境的安全。水樣中殘留喹諾酮類抗生素，通過飲用進入人體，可能對人體肝臟功能造成嚴重損傷。因此，建立水環境中這類藥物的檢測方法尤為重要。目前，喹諾酮類藥物殘留檢測方法，主要包括HPLC-UV、HPLC-FD、HPLC-DVD、LC-MS/MS、LC-ESI-MS/MS，另外還有螢光光譜法、毛細管電泳法和酶聯免疫法等。

圖-1. 16種沙星類抗生素的結構式


本實驗選擇MCX陽離子交換柱進行富集、淨化，超高壓液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）聯用技術檢測，建立了環境水樣中高靈敏的分析方法，該方法有望應用於水產養殖中。

關鍵字：全自動固相萃取；高效液相色譜-串聯質譜；抗生素

2.儀器、試劑以及耗材

Reeko Fotector Plus全自動固相萃取儀（睿科）

MCX 固相萃取柱（Oasis，200 mg/6 mL）

高效液相色譜：（HPLC）Agilent 1260，質譜檢測器（MS）Agilent 6410

氮氣吹乾裝置：Reeko AutoEVA-60全自動平行濃縮儀

甲醇，乙腈（TEDIA 色譜純）；甲酸，氨水（優級純）

3.樣品製備與淨化

3.1 固相萃取淨化條件

全自動固相萃取儀睿科Fotector Plus 60位
固相萃取柱MCX（Waters，200 mg/6 mL）
活化甲醇
淋洗pH=4.0 的甲酸水溶液
洗脫5%的氨水甲醇溶液

3.2 富集淨化

依次用甲醇（10mL）和水（10mL）以5.0mL/min的速率活化/平衡和淋洗固相萃取柱，備用。取純淨水樣200mL，如為加標樣品，請加入標準品（100 μL，100 ppb），加入EDTA-MCIlvaine緩衝溶劑（50mL，0.1 mol/L）調節水環境的pH為4，以5mL/min的速率經固相萃取小柱富集後；用甲酸水溶液（pH=4.0）10 mL以10 mL/min速率淋洗；氣推後用10 mL的5%氨水甲醇以1.0mL/min的速率洗脫。收集的樣品在25 ℃，5 psi條件下濃縮至近幹，流動相乙腈-水溶液（10：90，v/v，0.1 %甲酸）定容至1.0mL，供LC/MS-MS分析。全自動固相萃取方法見圖-2。

圖-2. Fotector Plus水中沙星抗生素固相萃取方法


4.液質檢測條件

4.1 色譜柱條件

4.2 MRM參數

表-1. 16種抗生素的串聯質譜檢測參數


4.3 16種沙星類抗生素的保留時間譜圖

5.樣品測試

5.1基質效應驗證

取純淨水樣，按照上述的樣品處理步驟後，氮吹至近幹，加入標準使用液（1ppm，20 μL），定容成1mL，供LC/MS-MS檢測。如果基質加標濃度準確，則可以直接用標準曲線對樣品進行定量；如果不準確，請使用含有基質的工作曲線進行定量。

選擇定量離子的峰面積作為縱坐標，濃度作為橫坐標，做相關曲線，曲線為線性回歸，各點權重相等，擬合出工作曲線，要求R2>0.99；此曲線兩周需要重新配置一次。

5.2 樣品基質加標測試

對桶裝純淨水和生活廢水進行加標實驗，加標濃度為低濃度（25 ng/L）、中濃度（50 ng/L）和高濃度（100 ng/L），結果如表-2所示：除了恩諾沙星和司帕沙星在76.9%~79.4%外，大部分的加標回收率在82.5%~114.2 %之間，RSD 1.5%~16.6%。該方法能夠實現對水樣中16種喹諾酮抗生素進行檢測。

表-2 不同水樣的加標回收率

5.3 不同類型固相萃取柱對沙星類化合物的富集效果

取純淨水為樣品，加標的質量濃度分別為50 ng/L，按照上述方法，進行4平行樣測定，考察該方法的不同固相萃取柱的回收率和重現性，分析結果如圖-4所示：純淨水中抗生素的平均回收率分布在65.00%-91.38%（HLB），71.21%-152.28%（MAX）和77.41 % -123.21 %（MCX）。HLB回收率普遍偏低，MAX柱中沙星的回收率偏高，培氟沙星和氧氟沙星的回收率均超過了140 %，而且MAX柱需要在水樣中加入氫氧化鈉，容易造成水樣中金屬離子的水解沉澱，容易造成管路的堵塞。相比之下MCX柱的平行性比HLB柱和MAX好，回收率大部分在90 %-110%之間，除了恩諾沙星回收率偏低，只有77.41 %。

圖-4. 三種柱子的回收率對比

6.結果與討論

6.1 對於16種沙星類化合物在水中的富集方法，應考慮實驗過程中基質對化合物檢測的幹擾。此步的幹擾不僅來自於水樣中雜質幹擾，同時商業化的固相萃取小柱，使用的色譜級溶液等等都存在幹擾雜質，因此需要進行基質效應確認，以避免前處理富集過程中存在基質效應。

6.2 氮吹濃縮過程中應控制吹乾程度，不可過分乾燥。

6.3 對於沙星類的兩性化合物，在pH=7.0左右時，主要以帶負電荷的形式存在水溶液中，此時進行富集，固相小柱無法對目標物進行吸附。因此需要進行pH調節至4.0左右，使其成為帶銨根的正離子，利於下一步進行陽離子交換柱富集。

6.4 淋洗時採用甲酸酸化的水溶液，利於將固相萃取小柱中殘留的EDTA除去，避免其在後續的洗脫液中幹擾沙星類化合物的檢測。

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