2020版《中國藥典》 | 睿科中藥材中黃麴黴毒素測定的解決方案

1.介紹

黃麴黴毒素（Aflatoxins, AF）是一類由黃麴黴和寄生麴黴產生的代謝產物，具有誘發人體致畸、致癌、致突變的作用，主要的汙染物有黃麴黴毒素B1, B2, G1, G2。中藥材大多以天然植物為基源，在儲存不當或因其他外界條件影響時，易受黴菌汙染產生黃麴黴毒素。因此對中藥材進行黃麴黴毒素的高效便捷檢測是十分有必要的。

參考2020年版《中國藥典》四部通則中《2351 真菌毒素測定法 黃麴黴毒素測定法》第一法，試樣經過70%甲醇水提取，提取液經稀釋、離心後，使用Raykol Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀，濾液自動化經過含有黃麴黴素特異抗體的免疫親和柱淨化和富集後，目標化合物通過帶有三重四級杆質譜檢測器的高效液相色譜儀進行測定，建立了中藥材中黃麴黴毒素高靈敏度的前處理和分析方法，並進行三種常見中藥材（陳皮、人參、當歸）中黃麴黴毒素的加標回收驗證，平均回收率在84.5~101.3%之間，RSD小於10%。

2.儀器、耗材

儀器

Raykol Fotector Plus 高通量全自動固相萃取儀

Raykol Auto EVA-60 全自動平行濃縮儀

Raykol AH-30 全自動均質器

Raykol Auto Prep 200 全自動液體樣品處理工作站

高效液相色譜（HPLC）：Agilent 1200

質譜檢測器 (MS)：Agilent 6430

耗材

黃麴黴毒素免疫親和柱

試劑

緩衝液：稱取25 g氯化鈉、5 g碳酸氫鈉溶於水中，加入0.1 mL吐溫-20，用水稀釋至1000 mL即得淋洗緩衝液。

使用Auto Prep 200全自動液體樣品處理工作站配製黃麴黴毒素混合標準工作液，具體配製方法如圖-1所示：

圖-1 Auto Prep 200 黃麴黴毒素混合溶液配製方法

空白基質溶液用Auto EVA -60全自動平行濃縮儀氮吹後，分別加入1 mL上述混合標準工作溶液復溶，過0.22 μm的有機相濾膜後配製成基質混合工作溶液，供液相色譜-質譜聯用儀測定。 

3.樣品提取與前處理

陳皮、人參、當歸試樣前處理

準確稱取15 g試樣於120 mL離心管中，加入3 g氯化鈉及75 mL甲醇-水溶液（7:3，V/V），12000轉/分鐘攪拌速度下均質2 min，離心5 min（轉速4000 r/min）。準確量取15 mL上層提取液於50 mL容量瓶中，用水定容、取30 mL至50 mL離心管中, 離心10 min（轉速4000 r/min），最後準確移取20 mL上清液至80 mL玻璃上樣管，待淨化用。

固相萃取淨化條件

淨化方法

淨化過程採用黃麴黴毒素免疫親和柱進行富集淨化，具體方法如下：

清洗樣品通道：用甲醇清洗；

上樣：採用2 mL/min的流速進行精確上樣20 mL；

淋洗：採用緩衝液和純水進行淋洗小柱；

氣推：用60 mL空氣將水擠出免疫親和柱；

洗脫：以0.5 mL/min的速度用甲醇進行洗脫，開始收集溶液；

氣推：將柱子裡溶液用空氣推出，收集溶液。

將收集液用甲醇定容至2 mL，混勻後過0.22 μm濾膜用液質檢測。詳細步驟見圖-2。

圖-2 Fotector Plus黃麴黴毒素的免疫親和淨化方法

4.液質聯用色譜圖

4種黃麴黴毒素標準溶液的MRM色譜圖

5.樣品測試

基質標準工作曲線

選擇定量離子的峰面積作為縱坐標，濃度作為橫坐標，做相關曲線，曲線為線性回歸，各點權重相等，擬合出工作曲線，要求R2>0.99。

基質加標回收實驗

在陳皮、人參、當歸3種常見樣品基質中添加水平為1.8 μg/kg的黃麴黴毒素G2、B2和6.0 μg/kg的黃麴黴毒素G1、B1進行加標回收驗證，平均回收率和RSD結果見下表：

表-1 平均回收率和相對標準偏差 (n=4)

6.總結

A.提取液需加入水進行稀釋、定容至50 mL後才可進行淨化，以防止過多的有機溶劑使免疫親和柱失活。

B.在人參和當歸的淨化過程中，如採用20 mL水作為淋洗液，其加標回收率為70~80%；而將10 mL的緩衝液和10 mL的純水作為淋洗液時，可除去免疫親和柱上殘留的色素和基質，從而提高回收率。

C.進行洗脫時甲醇的過柱流速控制在1滴/s為宜。洗脫效果不佳時，可採取讓甲醇浸泡免疫親和柱後再加以洗脫。

D.由於黃麴黴毒素在紫外光照射下不穩定，因此在實驗過程中應避免紫外光和太陽光的照射。

7.解決方案優勢

通過高通量全自動固相萃取儀進行淨化和富集，能自動化進行免疫親和柱自動脫帽和樣品上樣、淋洗和洗脫等過程，8種溶劑可選，6個樣品通道同時運行，能連續、批量處理多樣品，實現高通量、自動化固相萃取過程。

整體解決方案可實現樣品快速高效處理，提高工作效率。同時自動化前處理解決方案可解放實驗人員雙手，也避免有機溶劑的毒害。

配液

睿科 全自動液體樣品處理工作站

提取

睿科 全自動均質器

濃縮

睿科 全自動平行濃縮儀

淨化富集

睿科 高通量全自動固相萃取儀