人源hESC/iPSC被化學成分明確了無飼養層培養基

2021-01-09 中國教育裝備採購網

  自從人類的胚胎幹細胞(ESC)和誘導多能性幹細胞(iPSC)出現以來,將它們應用於人類的疾病治療就成了廣大科研工作者不懈的奮鬥方向。由hESC/iPSC直接分化出組織和器官,替換病變的部位,能夠突破當今傳統醫藥學無法逾越的極限。然而,目前hESC/iPSC的研究和應用依然局限在實驗室範圍內,其中一個重大因素就是配方複雜、成分不明確的hESC/iPSC培養基。

  培養基中的動物源成分是阻礙幹細胞應用於臨床的最主要因素。

  最早期的hESC/iPSC培養基都含有胎牛血清(Fetal Calf Serum, FBS)。FBS是從胚胎期10至14天的小牛的血液中直接提取的血清,內含血漿蛋白、多肽、生長因子、激素等多種因素。去除FBS中促使ESC/iPSC分化的成分,得到化學成分更確定的血清替代物,這就是KOSR(Knockout Serum Replacement)。然而,無論是FBS還是KOSR,其來源都是成分複雜的自然提取物,使用它們配成的培養基會帶來許多不利影響。

  首先,FBS和KOSR中含有的未知成分的作用不明確,會對細胞產生多方面的複雜影響:如影響ESC和iPSC的狀態,使得細胞克隆形態鬆散,邊緣趨向於分化;影響ESC和iPSC的多能性,降低它們的分化潛能;屏蔽細胞與外源因子的相互作用或影響細胞內的代謝和信號傳遞,使某些藥物的功能試驗無法進行,甚至得到謬誤的結果。

  其次,自然提取物的質量無法穩定控制,使得每一批次的培養基效果不一致,實驗的重複性不高。低質量的培養基甚至會對ES/iPS細胞系的狀態產生負面的不可逆影響。

  再次,FBS和KOSR都是動物的提取物,並且其培養的ESC/iPSC依賴於小鼠的飼養層(feeder)(人源的飼養層來源稀少、價格昂貴)。人類的ESC和iPSC長期在動物來源的培養基中培養,可能會發生適應性的改變,使得它們在應用到人體中時產生免疫排斥、功能不全等不良結果。

  首次去除hESC/iPSC培養體系中的動物血清成分的培養基是mTeSR1培養基,它含有19種成分,幾乎完全使用了人類來源的重組蛋白和有機化合物代替了血清。然而其中的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA),使得mTeSR1培養基仍存在動物來源的不確定因素。

  2011年,威斯康辛大學麥迪遜分校Morgridge研究所的Chen等在Nature Methods上發表文獻稱,在mTeSR1培養體系中去除了β-巰基乙醇後,BSA的存在變得沒有必要。他們進一步測試了培養基中其它成分的作用,最後得到了一種只由8種成分組成的hESC/iPSC培養基,並將之命名為E8(Chen et al., 2011)。

  E8培養基是一種化學成分完全明確的、所含蛋白均為人重組蛋白的無飼養層(feeder-free)培養基。由E8培養基培養得到的hESC/iPSC,具有優於血清培養體系下的hESC/iPSC的克隆形態、多能性幹細胞marker表達以及向各個胚層分化的能力,與mTeSR1培養得到的hESC/iPSC沒有明顯差別。E8培養基支持hESC和iPSC的feeder-free培養,配合人重組vitronectin基質鋪皿,可以得到比在Matrigel上培養更緊密、形態更規則的克隆。

  據以往研究結果,培養基中含有的各個成分都對細胞具有不止一種作用(多態性),有些作用可能還不為人們所知,而成分之間以及它們產生的下遊信號之間的相互作用產生的影響更為錯綜複雜。因而僅含有8種成分的E8培養基對細胞的未知影響更小,較其它培養基在細胞功能試驗上更具優勢。

  最後,E8培養基所含的8種成分的生產過程都是可控的,因而不同批次的培養基質量一致,經測試不同批次的E8培養基培養的得到的ESC/iPSC都具有相同的最佳多能性特徵。並且細胞可以直接從非E8培養體系轉入E8培養體系,而不產生適應的遲滯期。

  在幹細胞研究的臨床推進之路上,E8培養基有著得天獨厚的優勢,這預示著由此產生的培養方法,將成為幹細胞培養的主流技術。具體的優勢可以總結為:化學成分明確、無動物源成分、支持無飼養層培養;培養得到的hESC/iPSC克隆形態規則、緊密、不易分化,多能性marker高表達,並具有向三胚層分化的能力;簡單的組分減少了對細胞自身生化過程的影響、避免了對進行測試的外部因子和藥物作用的幹擾;不同批次的培養基質量穩定、可重複性高,是目前最為優秀的應用於臨床級別hESC/iPSC培養的培養基。

  E8培養基需與其相應的試劑組成培養體系,得到最佳的培養效果,例如用人重組vitronectin鋪皿、用無酶的溫和消化液傳代等。

 

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