飼養層細胞(Feeder)的製備
註:含10 ug/ml絲裂黴素C的DMEM血清培養基(FBS佔10%)(實驗室所用MMC為10 mg/mL,Calbiochem)
1.棄去細胞培養皿中的培養液,加入適量含10ug/ml絲裂黴素C的培養基(DMEM+10% FBS);上海創賽科技提供絲裂黴素C,Mitomycin C,≥970 µg/mg,USP31,BR,可用於細胞培養,50-07-7,商品編號:C84-1164-5mg,價格259元。
2. 放入培養箱培養3小時(2-4小時);
3. 用0.1% 明膠處理培養皿(將明膠加入,搖動使明膠覆蓋全部皿底,然後吸出明膠棄去即可),室溫放置2小時以上,至皿底明膠乾燥為止;上海創賽科技提供明膠,Gelatin,商品編號:B11000719-100g,價格241.5元。
4. 棄去含有絲裂黴素C的培養基,加入2-3 mL PBS,輕輕搖動,棄去PBS,如此洗3-5次(必須洗3次以上,以便徹底洗去殘存的絲裂黴素,絲裂黴素是有絲分裂抑制劑,因而對ES細胞有毒性);
5. 加入適量胰酶消化30秒,吸去消化液,靜置至細胞層出現裂縫或明顯滑壁為止,加入培養基,吹打,種至明膠處理過的培養皿中即可(如細胞過稀,可再補加絲裂黴素處理過的細胞),半小時後即可使用(如果急用,則可以用ES細胞培養基終止消化,然後與ES細胞一起轉入明膠處理過的新板上),可使用6-10天,用前更換培養液(如未用明膠處理培養皿,則需在培養箱中放置2小時以上方可使用;最好是前一天下午製作Feeder,第二天上午使用,這時的Feeder狀態最好,最適於ES細胞貼壁生長,而且萬一製作的Feeder在第二天早上發現出了問題,還可以趕緊補做)。上海創賽科技提供8049-47-6,胰酶(11×USP),Pancreatin-11.0 from hog pancreas,商品編號:C84-0033-100g,價格364.8元。
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