PRF製備方法研究進展

作者：吉林大學口腔醫院（李豔秋）；吉林大學第二醫院（劉金鳳，張海鑫，徐雲）

 

隨著種植技術的不斷發展，大量的臨床研究面臨著的挑戰之一就是尋找新的能夠同時增加組織癒合和調節炎症的生物添加劑。自1984年Assion首次從人血漿中提取富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）後，大量的研究表明濃縮的富血小板中存在的生長因子具有促進骨組織再生的作用。

 

1997年，Whitman首次將PRP應用於口腔研究之中，效果顯著。但隨著研究的進展，PRP的應用也存在著爭議。因為PRP的製備過程需要加入異種凝血酶和抗凝血製品，可能會導致免疫排斥反應的發生和感染性疾病的傳播。2001年，Choukroun等人在法國製備出了PRF（富血小板纖維蛋白）成功的解決了這一爭議，成為第二代的濃縮血小板製品，並廣泛的應用於加速軟、硬組織的癒合之中。

 

1 PRF概述

 

富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF），是一種包含白細胞和富血小板纖維蛋白基質的濃縮物，PRF的分子結構類似於天然血凝塊，可以藉助細胞因子的調節作用以及纖維蛋白的支架作用進行組織修復。DohanDM等研究認為PRF具有逐步釋放細胞因子的生物特性，因為沒有加入任何的抗凝和促凝物質，其血液凝結過程完全模擬自然凝血的過程。成纖維細胞和成骨細胞的原代培養實驗表明，PRF能夠明顯的促進細胞增殖和分化。

 

2 PRF優缺點【見表1】

 

3 PRF的製備方法

 

PRF的製備方法有兩種，第一代的製備方法是抗凝管採集全血後高速離心分為3層，提取血漿層和富血小板層，加入到1個含有CaCl2的試管中離心15min，得到1個穩定的PRF膠。但是此種方法仍然添加了生物製劑，目前已很少使用。同時，Leitner等的研究認為該方法與常規凝血酶激發PRP產生PRG的方法釋放生長因子的能力沒有差別。第二代的製備方法就是目前臨床使用的方法，只需在術前收集患者的靜脈血於乾燥的未加入抗凝劑的離心管中進行低速離心。

 

經過離心，離心管內的血液分為三層，上層為淡黃色的貧血小板血漿層（PPP），底層為紅細胞碎片層，二者之間即為富含血小板的纖維蛋白凝膠層。其製備原理是通過離心使血液分層，因為靜脈血中含有天然的凝血酶，在其作用下使得纖維蛋白原緩慢凝結為疏鬆的纖維蛋白網狀結構，其中就包含了大量的血小板和白細胞，可以直接應用於臨床。但是這種方法也有不足之處，由於在製備過程中血小板被活化，導致一定量的血小板和白細胞釋放的生長因子嵌入纖維蛋白網狀結構中，難於釋放到創傷組織中，從而對治療效果產生影響。由於沒有加入抗凝物質，血液接觸離心管的同時即開始了凝固的過程，因此，此過程的重要方面是高效，要求快速採血，立即離心，如果從採集血液到放入離心機的時間過長，就會有血凝塊的產生導致失敗。

 

4影響生長因子發揮的因素

 

PRF之所以能夠促進軟、硬組織的生長，有賴於其內的多種生長因子，主要見表2。

 

4．1離心機的轉速和離心時間

 

DohanEhrenfest等的研究表明大約97%的血小板和大於50%的白細胞存在於PRF中，並且PRF特殊的三維結構主要取決於離心速度。對於PRF的離心時間和轉速，國內外的文獻研究較少，目前未見統一的標準。國內方面，李豔秋等的研究認為3000r/min，離心10分鐘所獲得的PRF釋放的TGF-β和PDGF-AB含量最高。國外文獻中未見相關的研究，不同學者只是給出了參考性的標準，如Dohanetal（2010）認為3000r/min，離心10分鐘；RajaandNaidu（2008）認為2700r/min，離心12分鐘；Choukrounetal（2006b）認為2500r/min，離心10分鐘；Tsaietal．（2009）認為3000r/min，離心12分鐘。

 

4．2離心管的材質現有的研究

 

大多數強調乾燥和無添加的試管。目前較多使用的離心管有塑料和玻璃兩種材質，李龍、趙建輝等的研究表明，玻璃質地的離心管制備出來的PRF，其持續一周釋放的VEGF含量高於塑料離心管制備出來的，而且在離心結束時，用肉眼就可以明顯的看到玻璃離心管內的分層比塑料管的清晰。

 

針對有學者提出的用玻璃管制備的富血小板纖維蛋白（PRF）可能被試管所釋放的微量矽元素汙染而有一定的細胞毒性的說法，DavulM-Dohan等（2007年）在含有四名志願者PRF的有玻璃內層的塑料培養皿內分別培養了同一患者的牙齦成纖維細胞、脂肪細胞、角質細胞、成骨細胞組成實驗組，另外不添加PRF的四例組成對照組。分別作細胞毒性試驗（MTT試驗）測試細胞內線粒體呼吸的改變。結果顯示PRF組均未顯示細胞毒性，而且MTT試驗結果證實PRF組的角質細胞和脂肪細胞比對照組的好。所以他們認為PRF作為一種自體源性的生物材料是絕對安全的。

 

4．3除水方法

 

臨床使用PRF，是通過使用兩塊無菌紗布快速擠壓的方法除去水份，從而得到PRF膜，李豔秋，等的研究通過採取快速除水和緩慢除水的方法的表明，二者釋放的TGF-β和PDGF-AB含量無顯著性差別。國外方面，R．Vinaya Kumar的文章中提到一種由法國尼斯Process公司生產的PRFBOX來製備PRF膜片的方法。該方法通過將從離心管中取出的PRF凝塊置於PRFBOX中的小格子中後蓋上壓縮機和蓋子，經過大約一分鐘的時間得到一塊PRF膜，供臨床使用。由於PRFBox擠壓過的膜片能保持一個恆定厚度，可以持續幾個小時鎖住從纖維蛋白中分泌出來的富含纖連蛋白和玻連蛋白的血清。同時，底部的盒子可以收集膜片滲出液用於臨床移植物的保存和手術中的傷口的溼潤。

 

4．4溫度

 

李丹，張劍明，羅曉丁等的研究表明超低溫冷凍後PRF雖然仍存在促進骨組織和軟組織再生修復的功能，但由於其組織出現彈性減弱，脆性增加易破的特性，不推薦臨床運用。此外，李龍，趙建輝的研究的研究表明，保存於4℃的PRF膜片所釋放出來的VEGF含量高於保存在37℃的環境中。一般臨床使用的都是新鮮的PRF，對於這方面的研究也比較多，而Kang等，將新鮮的PRF冷凍於-80℃中，經過一小時，將漏出液以230g離心10分鐘得到PRFextract（PRFe），進行研究發現PRFe能夠刺激基質金屬蛋白酶9、CD44、轉化生長因子β1的提高從而促進人牙槽骨髓基質幹細胞的增殖、遷移及分化，但是由於經過冷凍壓縮，PRFe中沒有血液細胞的存在。這與李丹，張劍明，羅曉丁等的研究結果一致，不推薦臨床使用。

 

5討論

 

隨著對PRF的研究不斷發展，其生物特性也得到認可，應用領域不斷的拓展。PRF的主要作用機制包括①引導損傷部位組織的血管新生。②促進上皮增殖，封閉損傷部位。③網絡免疫細胞，進行炎症調節。④引導循環血中幹細胞的遷移、增殖和分化。但是，由於PRF製備方法簡單，這方面的研究也比較有限，因此，很多的製備協議也都是約定俗成，缺少科學的依據和比較權威的標準，很多方面還有待考證。本文中提到的一些影響生長因子及其生物活性發揮的因素很多都是缺乏科學實驗進行驗證，現有的結果也有待考證。

 

來源：中國口腔種植學雜誌2016年第21卷第1期

 

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