來源：來源網絡 2007-03-20 23:33
一、材料和試劑
1、0.01M PBS(pH7.4)： NaCl 8.0g； KCl 0.2g； Na2HPO4 1.44g； KH2PO4 0.24g； ddH2O至1000ml ； 高壓滅菌,分裝。
2、0.25%胰酶：稱取EDTA 0.02g NaCl 0.8g KCl 0.04g 加三蒸水100ml溶解後加0.25g 胰酶,輕輕攪動,使胰酶溶解,不要產生泡沫,加酚紅少許,調PH值到8.2-8.6,過濾除菌,分裝10ml/管,-20℃保存,臨用前預溫到37℃。
3、誘導液(TPA)：12-鄰-十四醯-佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate,TPA)溶於丙酮，配成20mg/ml。
二、實驗步驟
(一) 、用96孔細胞培養板製備貼壁細胞抗原(正常貼壁細胞)
1、HFF,NIH3T3細胞用含10%血清DMEM完全培養液在75cm2培養瓶中單層培養,使密度達到90%
2、傾去培養液,用無菌PBS液5-10ml洗細胞一次,用無菌吸管吸乾PBS液。
3、加0.25%胰酶(從-20℃取出,在37℃預溫)75平方釐米培養瓶加1ml,37℃溫箱或有經驗者可在酒精燈周圍,控制溫度約37℃左右,輕輕搖勻使胰酶充分覆蓋細胞表面。
4、觀察到細胞有鬆動,成流沙狀下落;或在顯微鏡下觀察,細胞已有收縮變圓時,用無菌PBS液15-20ml,終止反應。
5、輕輕吹打下細胞,使細胞單個分散,並充分混勻1500轉/分離心5-10分鐘,去掉上清液
6、打散細胞,加10ml含血清DMEM完全培養液混勻,取10ul在顯微鏡下計數,計算細胞濃度。
7、用含10%血清培養液調整細胞濃度至1×104個/100ul,每孔(96孔)接種200ul(即2×104個細胞/孔),37℃ CO2培養箱培養。
8、次日顯微鏡下觀察,細胞是否完全貼壁(一般24小時可完全貼壁)倒去培養 0.01M PBS液先二次(孔中加滿PBS,輕輕倒掉)並在濾紙上扣幹,反覆3次)應 注意加液的力度,不能太大,以免衝掉細胞,倒去上清液在濾紙上扣幹水份,但保持細胞溼潤。
9、加90%冷丙酮固定,每孔200ul,5-10min 摔去冷丙酮,用PBS洗三次,扣幹。
10、在培養板上作好標記(細胞名稱,製備時間)。
11、保鮮膜封好,-70℃保存。
(二) 、懸浮細胞玻片法的抗原製備
1、 25平方釐米玻璃瓶用含10%血清的1640完全培養液培養BCBL-1細胞,密度達到80-90%
2、加樣槍充分吹勻細胞,收集於離心管中。
3、1500轉/分離心5-10分鐘,棄去上清液。
4、打勻細胞,用PBS洗二次,棄去上清。
5、打勻細胞,加少量PBS液(根據肉眼觀察細胞溶液的濁度估計)混勻,取少量在顯微鏡下計數,調整濃度,估算在玻片上每個細胞塗片圈位 (12圈)接種細胞1×104個。
6、室溫下乾燥,然後加100%的冷丙酮室溫固定3-5分鐘,PBST洗二遍。
7、室溫乾燥,作好標記然後放入玻片盒 ,玻片盒用塑膠袋密封,並放一袋防潮劑,-20℃保存,一個月內有效。
(三) 病毒感染細胞抗原的製備
1、96孔培養的貼壁細胞的病毒感染及病毒抗原的製備
1) 未感染細胞接種到96孔板(方法見」懸浮細胞玻片法抗原製備」1-5步),並完全貼壁。
2) 摔去PBS液,加入少量病毒液(加入量由先做棋盤試驗來確定濃度,或先測定病毒滴度而定,且病毒液用2%-5%血清DMEM完全培養液稀釋),每孔50ul,搖勻,使充分覆蓋細胞表面 ,37℃ CO2培養箱培養（MCMV感染NIH3T3 HCMV感染HFF）。
3) 每天觀察細胞形態變化,早期CPE為細胞腫脹,中期聚集,晚期則圓縮。
4) 當圓縮細胞達到10%-30%左右,細胞層出現明顯的病灶,同時還有正常細胞未感染,即可收穫(一般情況下3-4天)。
5) 倒去上清(倒入有消毒液容器以防止汙染環境),用無菌PBS液洗2次(加滿培養孔,倒掉,在濾紙上扣幹)。
6) 倒去上清,加90%冷丙酮室溫固定5-10min,每孔200ul 。
7) 摔去冷丙酮,用PBS洗三次,扣幹。
8) 在培養板上作好標記(病毒抗原名稱,製備時間等)。
9) 保鮮膜封好,-70℃保存。
2、BCBL-1細胞的誘導和KSHV病毒抗原的製備
<1> BCBL-1細胞擴大培養，細胞密度達到50%
<2> TPA（12-0-醯佛波醇-13-乙酸酯），每毫升培養液加40ug（TPA預先配成 20mg/ml）。
<3> 誘導三天後，收集少量細胞進行ICC預實驗。
<4> KSHV陽性細胞達到10%-30%時，可做細胞塗片，陽性細胞>30%時,可用於製備病毒細胞裂解液。
<5> KSHV陽性細胞達到10%-30%時,即可收穫細胞加樣槍充分吹勻細胞,收集於離心管中。
<6> 2000轉/分離心5-10分鐘,棄去上清液。
<7> 打勻細胞,用PBS洗二次,棄去上清。
<8> 打勻細胞,加少量PBS液(根據肉眼觀察細胞溶液的濁度估計)混勻,取少量在顯微鏡下計數,調整濃度, 估算在玻片上每個細胞塗片圈位 (12圈)接種細胞1×104個。
項目 MCMV HCMV KSHV
血清稀釋度 1:50 1:100 1:200 1:100 1:500 1:1000 1:50 1：100 1:200
測血清用二抗
HRP-Anti Mouse IgG(fc) Sigma
或HRP-Anti Mouse IgG+A+M Sigma Bio-Anti mouse IgG F(ab』)2 Sigma HRP-Anti Mouse IgG(fc) Sigma
或HRP-Anti Mouse IgG+A+M Sigma
測上清用二抗 Bio-Anti mouse IgG F(ab』)2 Sigma Bio-Anti mouse IgG F(ab』)2 Sigma HRP-Anti Mouse IgG(fc) Sigma
或HRP-Anti Mouse IgG+A+M Sigma
<9> 室溫下乾燥,然後加100%冷丙酮室溫固定3-5分鐘,PBST洗二遍。
<10>室溫乾燥,作好標記後放入玻片盒,玻片盒用塑膠袋密封,並放一袋防潮劑,-20℃保存,一個月內有效。
三、說明
1、 測病毒細胞ICC血清稀釋度及使用的二抗
2、細胞病變作用分三種類型
1) 全變型：即整個細胞都發生改變。
<1>整個細胞都發生腫脹,胞漿呈顆粒樣變,胞膜邊緣不整齊。
<2>整個細胞都發生皺縮,變圓直至碎裂,脫落等,多見於病毒。
2) 包涵體型：即反映在細胞核或細胞漿內出現病毒引起的包涵體。。
3) 融合型：即指多數病變細胞發生相互事例融合而呈」巨細胞」,但單個細胞的胞核仍可分辨。
3、細胞病變程度表示方法
通觀整個」單層區」權衡總的情況,雙下列符號表示其病變程度:
無細胞病變
+ 25%以下的細胞有病變
++ 25%-50%的細胞有病變
+++ 50%-75%的細胞有病變
++++ 75%-100%的細胞有病變
四、注意事項
1、病毒液應保存在-70℃,4℃保存病毒液病毒滴度會降低,保存不長久。
2、每次從冰箱取出抗原板或抗原片時,應在37℃預溫去掉水霧,用前要用3%的雙氧水(現配現用)除掉病毒細胞中的內源性過氧化物酶。
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