腫瘤免疫治療:CAR-T的靶向抗原

免疫療法是當下腫瘤治療領域最具前景的發展方向之一。隨著PD-(L)1等免疫檢查點抑制劑應用範圍逐漸擴大，CAR-T療法研究不斷出現新的進展，CAR-T療法作為有別於傳統藥物的「活藥」，不僅對復發、難治性腫瘤患者表現出了突破性療效，其生產體系和使用場景也有別於普通藥物。鑑於當下生物技術的更新速度，預計CAR-T療法還將帶給市場更多驚喜。  本報告擬從CAR-T療法技術基礎入手，分析CAR-T療法的局限性及研發方向、行業發展情況、研發情況與如何選擇國內標的、投融資情況及行業總結。

一 CAR-T的靶向抗原

CAR-T技術是靶向某一種抗原，而不是針對單一腫瘤疾病，因此靶點的選擇是CAR-T有效性和安全性的基礎。CAR-T靶向的腫瘤抗原可分為兩類： 

腫瘤特異性抗原：特異性地在腫瘤細胞表面表達，在正常組織中無表達，這是最理想的抗原。靶點抗原的特異性越高，CAR-T細胞就可越專一地針對特定的腫瘤細胞，對正常細胞不作用，從而降低機體不良反應。這種理想的抗原並不多，目前受到關注的有表皮生長因子受體EFGRvIII和前列腺特異性膜抗原PSMA等。 

腫瘤相關抗原：在腫瘤細胞表面過度表達，在正常組織中低表達，目前大部分應用的腫瘤抗原靶點都是這種；腫瘤相關抗原可分為幾種不同類型：免疫細胞的抗原通常與其抗原分化簇（CD）分型有關，包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD269（BCMA）等；參與生長和分化信號的抗原，包括癌胚抗原（CEA）、表皮生長因子受體（EGFR、HER2）、酪氨酸激酶受體（EPHA2）等；參與腫瘤血管生成的抗原，包括血管內皮生長因子（VEGF）、VEGF受體（VEGFR）等；腫瘤支撐結構的腫瘤間質和細胞外基質抗原，包括纖維細胞激活蛋白（FAP）、tenascin蛋白等。

CAR-T的主要靶點及對應適應症和作用原理

資料來源： Nature Reviews/Clinical Oncology-<Driving CAR T‑cells forward>，華創證券

從研發進展來看，應用於臨床最成功的案例是以CD19為靶點構建的CAR-T（此前諾華和Kite Pharma獲批的兩個CAR-T 產品均以CD19為靶點），主要有兩方面的原因，一方面，CD19抗原雖然是腫瘤相關抗原，但是它只在正常的B細胞和腫瘤B細胞上表達，以CD19為靶點的CAR-T會殺傷所有B細胞，當B細胞都被殺死之後，造血幹細胞可以補充新的正常B細胞，患者也可以通過輸入免疫球蛋白來補償正常B細胞損傷所產生的影響，因此即使清除了患者體內的B細胞，通常也不會對患者的健康產生嚴重影響；另一方面，回輸的CAR-T細胞自然歸巢於血液器官，如血液、骨髓和淋巴結等，CAR-T與B細胞接觸充分，有效作用殺傷。雖然以CD19為靶點的CAR-T細胞治療效果很好，但是其適應症也局限在B細胞相關的血液腫瘤中，比如B系淋巴細胞白血病（急性、慢性）以及非霍奇金淋巴瘤（瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤等）。

白血病和淋巴瘤分類

資料來源：華創證券

除了靶點CD19，BCMA、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123等靶點的開發均逐漸把CAR-T拓展到更廣泛的血液腫瘤治療上。這些靶點中，BCMA正在成為CAR-T治療的熱門靶點。BCMA作為一種極為重要的B細胞生物標誌物，之所以引起極大關注，是因為它的RNA幾乎總是在多發性骨髓瘤細胞中發現，並且該蛋白也存在於多發性骨髓瘤患者惡性漿細胞表面，而且，與CD19靶點類似，BCMA-CAR-T治療後雖然也殺傷了正常的漿細胞，但患者可以通過免疫球蛋白給藥來維持機體免疫力。雖然目前尚無相關產品獲批上市，但在臨床試驗中，靶向BCMA的CAR-T療法用於多發性骨髓瘤的治療已經獲得了很大的成功。美國bluebird bio和南京傳奇生物的靶向BCMA治療多發性骨髓瘤的CAR-T產品在臨床試驗中均達到了較高的客觀緩解率（bluebird: 94%，南京傳奇：100%）。

實體瘤靶點的研發較為困難，主要是因為以下三點： 第一，幾乎所有的靶點都是腫瘤相關抗原，CAR-T細胞在殺傷腫瘤細胞時容易誤傷正常組織，發生「脫靶毒性」；第二，實體瘤是一群異質性腫瘤細胞，不同突變腫瘤細胞上的靶點不一樣，單一種類的CAR-T很難殺光全部腫瘤細胞；第三，實體腫瘤就像獨立的器官一樣，擁有自己的血管、淋巴管、結締組織等，周圍的溫度、pH、滲透壓、細胞因子等微環境都與正常組織不一樣，正常的免疫細胞以及CAR-T等都可能會被腫瘤微環境所抑制，不能發揮免疫反應。

2018年中國腫瘤登記年報數據顯示，我國發病率最高的前10種癌症均為實體瘤，佔全部癌症的比例高達77%。2017年美國癌症年報數據也顯示，每年新增癌症病例中僅有不到5%的比例是血液腫瘤。因此，CAR-T實體瘤靶點的研發空間還非常巨大，任重道遠。

據Cell Trials的統計，截至2017年10月，全球大約50%的 CAR-T臨床試驗針對CD19靶向抗原，另有一小部分（約6%）使用的是由CD19與另一抗原組成的組合抗原。除卻CD19，CAR-T在血液腫瘤治療方面還有許多其他抗原，其中BCMA、CD22、CD20較為常見。

CAR-T在血液腫瘤中最常見的靶向抗原（除了CD19）

資料來源： Cell Trials

在實體瘤治療方面，以間皮素（Mesothelin）為靶點的CAR-T臨床試驗數量暫時處於領先地位。作為一個潛在的良好靶點，間皮素在實體瘤細胞中大量表達，但在正常組織中的表達水平卻很低。實驗數據顯示，間皮素在間皮瘤、胰腺癌和肺癌細胞表面均有表達。緊隨其後，針對磷脂醯肌醇蛋白聚糖3（GPC3）靶點治療肝癌、雙唾液酸神經節苷脂2（GD2）靶點治療神經母細胞瘤以及針對CEA靶點治療腸癌的CAR-T療法也受到了廣泛關注。

CAR-T在實體瘤中最常見的靶向抗原

資料來源： Cell Trials

二 CAR-T結構中抗體scFv的篩選

CAR是以抗體的scFv（單鏈可變區）識別腫瘤抗原的。因此，與單抗的研發路徑類似，CAR-T的研發也需要獲取和篩選單抗。雜交瘤技術是獲取單抗的基礎，該技術可獲得相應的分泌單抗的雜交瘤細胞。篩選出親和力高的單抗後，將相應的雜交瘤細胞凍存傳代形成穩定的細胞株，用於CAR結構中scFv序列的構建。

雜交瘤技術流程圖

資料來源：《淺談抗體領域的研究成果》

scFv由重鏈、輕鏈以及之間的linker連接而成，所以將不同的重鏈和輕鏈隨機組合，可以建成人源化的scFv組合抗體文庫，再通過表達量、穩定性、與抗原的親和力等指標進行篩選。如果收集攜帶特定腫瘤抗原的患者外周血B淋巴細胞（比如30-100例），通過提取其中的mRNA並反轉錄獲得cDNA，也可以作為全人源抗體庫的素材。

高通量篩選主要通過噬菌體展示技術。簡單來說，噬菌體展示技術是將外源的抗體基因與噬菌體衣殼蛋白基因融合，以融合蛋白的形式呈現在噬菌體的表面。這個技術最大優點是直接將表達出來的抗體與其基因型聯繫在一起，再利用抗原—抗體的特異性結合，將感興趣的抗體挑選出來。通過噬菌體技術，可高效的獲得scFv人源化片段，提高CAR-T的安全性和有效性。

噬菌體展 示技術

資料來源：《淺談抗體領域的研究成果》

scFv序列是CAR-T研發中的核心技術，從華創證券的調研信息來看，篩選一個合適的scFv序列時間成本和費用成本都不低，鼠源性的成本在幾十萬元，人源化的則需要上百萬元。目前很多科研機構使用的序列是從文獻上獲取的，原則上只能用於科研。所以如果是要做創新型CAR-T，進行商業化，則需要科研機構或企業自主研發篩選。

三 CAR-T的轉染載體與製備工藝

為實現CAR在T細胞上的表達，需要通過載體將CAR基因導入T細胞。理想的載體應該具有較高的基因轉染效率，穩定性好，不引起機體免疫反應等特點。目前有多種載體用於CAR-T細胞產品製備，包括病毒載體轉導（如γ-逆轉錄病毒載體或慢病毒載體）及非病毒載體轉染（如轉座子轉染、mRNA電穿孔轉染等）等，雖然已開展的臨床試驗中以病毒載體轉導的方式為主，但以非病毒載體轉染的方式也在不斷得到青睞。

逆轉錄病毒是一種RNA病毒，只能轉染分裂期細胞，目的基因可以長期表達，技術上較為容易，已具有20多年的臨床安全性研究歷史。慢病毒是以HIV病毒為基礎發展起來的載體，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，轉染效率高，插入誘變可能性小，是目前應用最多的載體系統。病毒基因轉移載體的主要優點是製造、生產相對容易以及能夠將遺傳物質穩定整合到宿主基因組中。然而，病毒載體的致病性和潛在的插入誘變可能性在人類臨床試驗中存在顯著的監管障礙，非病毒載體的開發顯得十分重要。轉座子和mRNA電穿孔技術是目前研究比較多的兩類非病毒載體系統。

相較於病毒載體，轉座子能呈遞更大的負荷，成本效益高，免疫原性低。基於轉座子的載體系統主要有兩種類型：睡美人（Sleeping Beauty，SB）系統和PiggyBac系統。轉座子最終可能發展成多功能T細胞基因轉移系統，但目前的DNA電穿孔方法通常產生較差的細胞活力，臨床應用中需要擴大T細胞培養以產生大量T細胞。

利用轉座子構建 CAR-T 細胞的原理

資料來源：World J Stem Cells-< New insights in chimeric antigen receptors>

目前，mRNA電穿孔被認為是最安全的T細胞基因轉導方法，其可轉導靜止或增殖緩慢的T細胞，轉導效率多在90%以上，且設計相對容易，性價比高。臨床上已經使用利用瞬時mRNA轉染產生的CAR-T細胞，然而，這種方法需要幾輪CAR-T細胞輸注。在臨床前模型中，mRNA電穿孔轉導的靶向間皮素的CAR-T能引起播散性間皮瘤異種移植物的消退，然而，在灌輸49天後一名患者出現了過敏性反應。

不同載體系統的比較

資料來源：華創證券

CAR-T細胞的製備需要一些小心操作的步驟，而且整個過程中都需進行質量監控測試。CAR-T的GMP製備工藝主要包括如下過程：T細胞收集和分離，T細胞激活和修飾，T細胞擴增，T細胞收穫與回輸。生產過程通常需要5-10天，從收集到回輸需要2-4周（根據病人的臨床狀態和化療預處理方案確定）。

四 展望

CAR-T細胞製造是一個非常複雜的過程，製造難、成本高已經成為了行業發展的瓶頸問題。目前，吉利德和諾華公司均採用的是集中生產模式，首先在醫院中提取患者的T細胞，然後將這些細胞運送至製造中心，在製造中心對T細胞進行基因工程設計，最後將設計後的T細胞運回醫院回輸至患者體內。然而，無論使用何種製造模式，成功的CAR-T細胞製造都依賴於端到端流程的優化能力，包括工作流程的簡化、產能規劃以及生產的可擴展性等等。傳統的製造工藝以及傳統設備已經不能滿足行業發展需求，自動化、全封閉的新一代製造工藝是未來趨勢。隨著CAR-T製造工業的發展，目前市場上已經有一些解決方案供CAR-T開發商選擇，例如博雅控股集團旗下的CAR-TXpress™、美天旎的CliniMACS Prodigy™以及GE公司的FlexFactory™等，這些平臺受到了整個行業的關注，業內人士也對它們充滿了期待。

自動化、全封閉的CAR-T製造工藝是規模化生產以及降低製造成本的有效途徑。隨著CAR-T療法獲批上市，市場對新一代製造工藝的需求日益劇增。目前，CAR-T製造創新專利陸續問世，CAR-T細胞合同定製開發與生產製造（CDMO）的服務模式也開始進入國內外市場，CAR-T療法迎來了全新發展階段，有望造福更多患者。

文 | 木子鵬