腫瘤免疫知多少:CAR-T治療實體瘤的障礙以及相應策略進展

 

CAR-T細胞免疫療法在血液惡性腫瘤的治療中取得了巨大的成功。以CAR-T為代表的細胞免疫療法目前也已經有兩款上市，即諾華的Kymriah以及Kite公司（現已被吉列德公司收購）的Yescarta被美國FDA批准用於治療B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)和瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。對於實體腫瘤而言，目前的CAR-T仍然還面臨許多困難，比如治療實體瘤效果不佳，不能夠有效地浸潤到腫瘤組織內部，CAR-T細胞生存時間不長等等。近年來已經嘗試了許多策略來克服這些障礙，包括用敲除PD-1表達或分泌細胞因子/趨化因子的方法來武裝CAR-T細胞，以及將CAR-T細胞與其他治療方法聯用。儘管有這些努力，到目前為止，仍然沒有CAR-T細胞療法被臨床批准用於實體腫瘤的治療。令人振奮和樂觀的是，科研人員攻克實體瘤的腳步從未停止。僅在中國就登記了幾十項用CAR-T細胞治療實體瘤的臨床試驗。為進一步了解CAR-T細胞治療各種實體腫瘤的現狀和趨勢，小編介紹下目前CAR-T的技術、障礙以及克服這些障礙的策略進展。

嵌合抗原受體(CAR)是CAR-T的核心成分，它賦予T以不依賴於MHC的方式識別和結合特定的腫瘤相關抗原(TAA)，使其能夠識別比天然T細胞表面受體(TCR)更廣泛的靶抗原。一個基本的CAR包括腫瘤相關抗原(TAA)結合域(通常來自單克隆抗體抗原結合區的scFv片段)、細胞外鉸鏈域、跨膜域和細胞內信號域。歷經十餘年 ， CAR-T經歷了三代 結構, 每一代結構都是在各個細節上突破, 最終CAR-T往更為精準 、更為高效 、更為持 久 的 方 向 發 展（圖1）。第一代CAR介導的T細胞活化是通過CD3ζ鏈或FcεRIγ上的酪氨酸激活基序完成的。然而第一 代CAR-T只有一個胞內信號組分，T細胞可以被活化，但無法大量增殖 ，持久性很差 ，T細胞增殖減少最終導致凋亡 ，T細胞的抗腫瘤活性在體內受到了很大限制 。第二代CAR-T具有兩個胞內信號組分 ， 包括一個共刺激分子 ， 如CD28 、4-1BB 、0X40， 這樣的結構決定了T細胞即便沒有外源性共刺激分子也可以不斷增殖 。諾華的Kymriah以及Kite公司的Yescarta均採用了第二代結構。為了進一步完善CAR的設計，許多研究開始聚焦於第三代CAR的開發，第三代CAR-T具 有 三 個 胞 內 信 號 區 ， 包 括 CD28 、 CD3ζ、 4-1BB 或 0X40 。研 究 表 明 ， 胞 內 有 三 個 共刺激信號的三 代CAR 結 構 使 細 胞 具 有 更 強 的 腫 瘤 裂 解 能 力 和 更 多 的細胞因子分泌，並 在 小 鼠 體 內 具 有 更 強 的 腫 瘤 抑 制 能 力 。第二代和第三代CAR-T在美國、中國和歐洲都有在進行臨床試驗。

圖1. CAR-T結構發展

   CAR-T細胞治療實體瘤的障礙                                 

 影響CAR-T細胞治療實體瘤的因素（圖2）

為了與腫瘤表面的目標蛋白結合，CAR-T細胞首先需要運輸到腫瘤部位。這是T細胞免疫療法正常發揮作用的基本前提。與血液瘤不同，在實體瘤的情況下，T細胞向腫瘤部位的轉移和浸潤往往受到免疫抑制微環境的極大限制。此外，與容易被CAR-T細胞靶向和到達的血液瘤不同，實體瘤分泌的一些趨化因子，如CXCL1、CXCL12和CXCL5阻止T細胞向腫瘤病變轉移和浸潤。由於T細胞上缺乏相應的趨化因子受體，使其很難運輸和浸潤到腫瘤部位，嚴重阻礙了CAR-T細胞發揮其所設計的免疫殺傷腫瘤細胞的能力。因此，為了克服這一障礙，需要對T細胞進行修飾，使其表達與相應的腫瘤源性趨化因子相匹配的趨化因子受體，使得DC細胞以及T細胞浸潤到腫瘤組織內部一起殺傷腫瘤。  一旦CAR-T細胞成功轉運到腫瘤部位，浸潤到腫瘤微環境是發揮抗腫瘤作用所必需的關鍵步驟。這是一個非常動態和受調控的複雜步驟：它涉及滾動、粘附、外滲和趨化作用。實體瘤具有獨特的組織病理學特徵，如大量的血管，以及腫瘤相關的成纖維細胞和髓樣細胞形成細胞外基質。雖然這些特徵有利於實體腫瘤的生長，但也給腫瘤部位的T細胞浸潤帶來了困難，從而阻止了T細胞與腫瘤細胞之間的持續接觸，而這是T細胞發揮細胞毒抗腫瘤作用所必需的。實體瘤內免疫抑制微環境具有特殊的組織病理學特徵，表現為血管密度高、血管滲漏廣泛、組織結構完整性差等。這些變化導致缺氧、低pH值、免疫抑制細胞、抑制性檢查點的增加，以及更多的腫瘤衍生細胞因子。以下是影響T細胞抗腫瘤作用的TME中的三個主要因素：實體瘤通常由大量的免疫抑制細胞組成，如調節性T細胞(Tregs)、髓源性抑制細胞(MDSCs)和腫瘤相關巨噬細胞(TAM)。這些細胞都起到保護實體腫瘤細胞不被宿主免疫系統殺死的作用。理論上，共刺激分子，如CD28和CD137，可能有利於腫瘤部位CAR-T細胞的激活和存活。此外，阻斷粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)依賴的MDSC的擴增和PD-L1的表達可能是增強CAR-T細胞抗腫瘤作用的潛在途徑。腫瘤源性細胞因子是阻礙實體瘤腫瘤免疫治療效果的可溶性因子。TGF-β是一種抑制性腫瘤細胞因子，在抑制抗腫瘤反應中發揮重要作用。TGF-β可以減弱CD8+效應T細胞功能，並可以促進Treg成熟。因此，理論上用抗體或小分子藥物中和TGF-β改善CD8+T細胞的功能。此外，細胞因子的激活，如白細胞介素IL-2和IL-15，提高了CAR-T細胞的抗腫瘤效果，特別是IL-12可以改變腫瘤微環境，通過招募和激活巨噬細胞和其他天然免疫細胞來消除腫瘤細胞，延長T細胞的存活期，因此提高了抗腫瘤療效。  抑制性免疫檢查點配體誘導免疫反應的抑制功能，通常在實體瘤中過度表達。例如，PD-L1是PD-1受體的配體，通過與PD-1結合來抑制CAR-T細胞的激活。目前抑制性免疫檢查點抗體正在與CAR-T細胞聯合治療進行了多項臨床試驗。實體腫瘤CAR-T細胞治療的主要挑戰之一是irAEs。有兩個主要機制導致CAR-T細胞療法的毒性增加。CAR-T細胞免疫治療後最危及生命的毒性是靶點/腫瘤上的毒性，它與不良反應有關，如細胞因子釋放症候群(CRS)。當與靶腫瘤細胞上的抗原結合時，輸注的CAR-T細胞被廣泛激活，導致大量炎性細胞因子的釋放。CRS的症狀包括發燒、乏力、噁心、嘔吐、腹瀉、皮疹、神志不清、幻覺、低血壓，甚至嚴重的多器官衰竭。IL-6似乎是CRS的主要介質，因此，改善這種副作用可以使用IL-6R抑制劑tocilizumab。FDA已於2017年8月批准tocilizumab治療CAR-T細胞誘導的CRS。另一種毒性來源於CAR-T細胞與靶抗原的結合，而該抗原也在正常細胞上表達。這種毒性可能導致健康細胞和器官的破壞。大多數CAR-T細胞靶抗原似乎不是腫瘤特異性的。因此，抗原特異性成為CAR-T治療的關鍵因素。為了降低這種毒性的風險，針對CAR-T細胞的安全抗原的選擇性至關重要，可以通過利用雙CAR靶向和調節單鏈可變片段(ScFv)的親和力來改善。實體瘤的主要生物學特徵之一是異質性。腫瘤的異質性顯著影響免疫治療效果，因為免疫靶點可能局限於一定數量的實體瘤細胞。因此，在CAR-T細胞治療中，提高靶點特異性和消除毒性是必要的。EGFR變異體III(EGFRvIII)被認為是CAR-T細胞唯一的腫瘤特異性抗原(TSA)。研究發現它只在人類癌細胞而不是正常健康細胞上表達，EGFRvIII靶向的CAR-T細胞精確靶向腫瘤細胞，有助於提高療效和降低毒性。當然TSA的短缺嚴重限制了CAR-T療法的應用。CAR-T細胞轉運需要腫瘤細胞分泌的趨化因子與效應T細胞上的趨化因子受體之間建立趨化遷移。不同的腫瘤類型會產生不同的趨化因子，因此相應的趨化因子及其相應的趨化因子受體是T細胞成功轉運到腫瘤部位的關鍵因素。與腫瘤細胞上的配體CXCL1結合的帶有趨化因子受體CXCR2的T細胞已被證明能有效地向黑色素瘤轉運。淋巴器官之中的纖維網狀細胞（Fibroblastic reticular cells）分泌的IL-17和CCL19能夠將外圍的T細胞和DC細胞有效地招募過來，以便維持T細胞集中的區域。在著名學術期刊Nature biotecnology發表了一篇題為「IL-7 and CCL19 expression in CAR-T cellsimproves immune cell infiltration and CAR-T cell survival in the tumor」文章，來自日本的科學家團隊通過將IL-17以及CCL-19基因轉入CAR-T細胞製備出能夠有效殺傷腫瘤的「超級CAR-T細胞」 能夠讓患有腫瘤的小鼠幾乎100%生存，這種細胞在體內存活時間更長並且能夠有效地殺傷腫瘤細胞.VEGFR-2在腫瘤相關的內皮細胞上高表達，已被選為促進T細胞浸潤的另一個候選者。攜帶VEGFR-2的CAR-T細胞已被證明可以產生持久的、增加的腫瘤浸潤和增強的抗腫瘤效果；FSHR（卵泡刺激素受體）對腫瘤血管生成也有促進作用，在許多腫瘤血管中都有表達，例如卵巢，肺，頭頸，胰腺， 肝等腫瘤，而在健康組織中不表達。Anixa Biosciences公司設計的 FSHR-CAR-T療法（圖3），將 CAR-T被改造表達FSH，以此識別並殺死表達FSHR的癌細胞，破壞腫瘤血管生長，進而抑制腫瘤生長。這種CAR-T細胞可能對TME免疫抑制不敏感，使得實體腫瘤更容易被滲透，其有望是第一個抗血管生成治療實體瘤的CAR-T藥物。

通過腹腔和腫瘤內注射的區域傳送T細胞也是傳送CAR-T細胞的一種直接方式。在一項I期臨床試驗研究中，以ErbB為靶點的CAR-T細胞通過腫瘤內注射輸送給頭頸部鱗癌患者臨床前數據顯示，將共刺激分子摻入CAR-T有助於CAR-T細胞逆轉免疫抑制的腫瘤微環境，例如，CD28共刺激克服了TGF-β介導的增殖抑制，並增強了T細胞對Treg細胞的抵抗力。也有研究證實通過在CAR-T細胞上引入TGF受體來抑制免疫抑制細胞因子可以提高CAR-T細胞的療效。在腫瘤微環境中，激活細胞因子(如IL-2、IL-12、IL-15)可以拮抗免疫抑制因子的作用，提高CAR-T細胞的效能。致力於開發基於同種異體基因編輯的CAR-T細胞(UCART)的法國生物科技公司Cellectis研究人員通過使用該公司專有的TALEN® 技術，重新利用T細胞活化途徑的三個主要參與者TCRα、CD25和PD1基因，從而使得CAR-T細胞能夠通過以腫瘤和時間依賴性方式微量分泌促炎細胞因子IL-12重塑腫瘤微環境（圖4）。研究中，與4隻未經治療的小鼠相比，細胞療法顯著提高了7隻淋巴瘤小鼠的存活率。因此能分泌細胞因子的「裝甲」CAR-T細胞，這是一種非常有前途的改善CAR-T細胞功能的策略。圖4.  TRACCAR T細胞與腫瘤細胞的結示意圖腫瘤微環境發揮免疫抑制作用的一個主要機制是誘導細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)和程序性死亡-1(PD-1)等表面抑制受體的表達上調。這些分子在抗原-受體結合後自然上調，以抑制組織內T細胞的激活，並維持外周耐受。對於黑色素瘤和腎癌等癌症的治療，檢查點抑制劑的應用，如PD1，CTLA-4和PD-L1抗體，可以改善患者的T細胞功能。研究也證實阻斷PD1介導的免疫抑制也能增強CAR-T細胞的治療效果。由廣東藥科大學附屬第一醫院、廣州安捷生物醫學技術有限公司以及雪梨科技大學合作開展報導了全球首個PD-1敲除的MUC-1 CAR-T治療晚期非小細胞肺癌初步研究數據，研究初步結果顯示PD-1敲除的MUC-1 CAR-T治療安全，可耐受，部分患者腫瘤明顯縮小，所有入組患者的症狀均有改善。來自 Memorial Sloan Kettering Cancer Center的Renier J Brentjens 課題組通過 修飾CAR-T細胞以分泌PD-1抗體的單鏈可變片段（scFv）（圖5）。這些分泌scFv的CAR-T細胞以旁分泌和自分泌方式起作用，以改善CAR-T細胞和腫瘤特異性T細胞抗腫瘤活性。這種方法可以提高安全性，因為分泌的scFv仍然定位於腫瘤，保護CAR-T細胞免受PD-1抑制，這可能潛在地避免與全身檢查點抑制相關的毒性。使用了多個體內模型都證明了分泌PD-1 scFv的CAR-T細胞增強了小鼠的存活。研究結果還表明了分泌PD-1 scFv的CAR-T細胞與用CAR-T細胞和PD-1 mAb聯合治療同樣有效甚至更加優越，表明PD-1阻斷的局部遞送在增強CAR-T細胞功能方面是有效的。相關成果發表在題為「Targeted delivery of a PD-1-blocking scFv by CAR-T cells enhances anti-tumor efficacy in vivo」的Nature Biotechnology學術期刊上。

   圖5. 分泌scFv的CAR-T細胞的旁觀者效應的示意圖鑑於腫瘤的異質性和抗原逃逸變異，CAR-T細胞治療的下一步發展是靶向多個抗原，類似於傳統化療的組合策略。這種方法通過靶向腫瘤微環境中的多個TAA或其他因素，增加了消除腫瘤的機會。有多種方法可以創造多特異性CAR-T細胞。基本方法一是構建一個包含兩種單一CAR-T細胞產品的池，即「CAR池」。研究證實，以EphA2為靶標的CAR和以FAPα為靶標的CAR來靶向腫瘤微環境，與單獨應用任何一種CAR相比，這種組合在顯示了更顯著的腫瘤殺傷作用。另一個方法是讓兩個(雙特異性bi-CAR)或更多(Tri-CARs)在T細胞中共表表達，這樣單個T細胞也可以具有雙重或多重抗原靶向的功能。HER2和IL13Rα2是抗腫瘤療法的比較好的候選分子，這是因為它們在大多數膠質母細胞瘤細胞表面上表達，但是體內正常組織中表達水平較低。發表在Journal of Clinical Investigation期刊上題為 「Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Rα2 mitigate tumor antigen escape」 文章中，以美國貝勒醫學院為代表的研究人員發現在膠質母細胞瘤模型中，共表達HER2和IL13Rα2CAR分子的Bi-CAR-T同時識別HER2和IL13Rα2，而且它的抗腫瘤活性要比使用各自的單價CAR分子好很多。到目前為止，EGFRvIII是唯一的腫瘤特異性CAR抗原，它完全局限於人類癌症，主要發現於膠質母細胞瘤。EGFRvIII陽性的腫瘤細胞可以被特定的CAR-T細胞精確靶向，從而提高治療效果並降低相應的毒性。在膠質母細胞瘤的動物模型研究中，EGFRvIII CAR治療產生了非常有希望的結果。李宗海/蔣華課題組與科濟生物醫藥團隊開發了一個人源化抗體，可以同時識別腫瘤細胞中的EGFR和EGFRvIII，但不識別正常組織中的EGFR，這樣既做到一箭雙鵰，而且可以避免在靶脫瘤的毒副反應。其體外試驗表明，該CAR-T細胞對於EGFR或EGFRvIII高表達的腫瘤細胞可以有效殺傷，但對高表達EGFR的正常細胞如角質上皮細胞沒有明顯殺傷；而進一步的動物實驗表明，利用該單鏈抗體構建的CAR-T細胞可以有效清除顱內的EGFRvIII以及EGFR陽性膠母細胞瘤。另外已經開發了各種靶向策略來提高CAR-T細胞治療的特異性和安全性。一種策略是用兩種不同的CAR修飾T細胞，從而有效地誘導腫瘤細胞和正常細胞分化。由中國武漢的華中科技大學和Cellyan Therapeutics公司聯合進行I期臨床試驗,檢驗了一款同時靶向BCMA和CD38兩種抗原的雙靶點CAR-T療法。它將靶向CD38和BCMA的單鏈抗體可變區片段與4-1BB和CD3ζ蛋白域融合在一起。通過同時靶向這兩種抗原，希望獲得更好的腫瘤殺傷作用的同時而又不增加毒副作用。

調節CAR的ScFv親和力也可以增強腫瘤特異性。降低CAR的親和力可以使表達靶抗原的正常細胞處於較低水平，從而避免靶上/腫瘤外效應。研究報導，親和力降低約1000倍的CD38靶向CAR被證實更適合於治療多發性骨髓瘤；具有微摩爾親和力的ICAM-1靶向CAR比納摩爾親和力CAR更適合治療實體瘤。因此，在實體瘤過表達抗原的CAR-T細胞治療中，通過ScFv的親和力調節是一條很有前途的策略。

CAR-T細胞療法已經在血液瘤中得到驗證並取得了成功，但目前在實體腫瘤中的成功率很低。為了使實體腫瘤患者受益，科研人員在 CAR分子設計方面，TME內靶點的選擇，改善CAR-T細胞轉運和浸潤，克服實體腫瘤免疫抑制微環境以及如何降低毒性方面，做了各種各樣的嘗試和努力，目前也取得了一定的突破和成功。小編相信將CAR-T細胞療法從僅僅是「有希望的」轉變為對實體腫瘤的「有效」治療將在不久就變為現實，從而使更多的實體瘤患者受益。

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8. Anixa Biosciences公司及其他公司官網。

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