血癌剋星,生命福音——嵌合抗原受體T細胞技術

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免疫治療在腫瘤治療中日益受到重視，包括免疫治療藥物和細胞免疫療法，雖然以化療為主的免疫治療藥物完全緩解率較高，但是仍有20%～30%患者死於腫瘤耐藥所致的復發和難治。近年來腫瘤細胞免疫治療成為最活躍、最有發展前途的一種治療手段。包括細胞因子誘導殺傷細胞療法、樹突狀細胞療法等，但大多數腫瘤細胞不斷表達自體抗原，使靶向這些抗原的T細胞通過免疫耐受機制被中和或移除，難成為主流細胞治療技術。臨床上把目光投向嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）免疫療法，這種利用基因工程改造CAR-T，是非主要組織相容性複合體（MHC）依賴的腫瘤特異性殺傷細胞，它具有高效率和持久性。

2014年7月美國食品和藥物管理局（FDA）通過瑞士諾華公司開發的個性化CAR-T療法CTL019突破性藥物認證，推動這種療法的研究。2015年10月中國CAR-T多中心臨床研究項目正式啟動。該項目在18家醫院成立了臨床研究中心，目的是為了評價CAR-T技術治療復發難治性血液腫瘤的安全性和臨床有效性，為更廣泛的應用於臨床治療提供依據。

一、CAR-T基本介紹及實現原理

CAR-T療法是嵌合抗原受體T細胞免疫療法，利用基因技術研究改造T細胞，基本過程是將識別腫瘤相關抗原（TAA）的單鏈抗體（scFv）和T細胞的活化序列在體外進行基因重組，形成重組質粒，在體外通過轉染技術，大規模擴增T細胞。

臨床上根據對CAR-T的不同修飾方法將其分為3代。第一代CAR將免疫球蛋白樣scFv和FcεRI受體（γ鏈）或CD3複合物（ζ鏈）胞內結構域融合形成嵌合受體，由單鏈抗體通過跨膜區域與胞內信號轉導區（ITAM）相連。CAR表達的穩定性依賴於所用的胞內信號依照T細胞活化的雙信號學說。第二和第三代CAR在嵌合受體上引入共刺激分子（CM），以提高T細胞的細胞毒性及增殖活性、維持T細胞應答、延長T細胞存活時間等。其中第二代CAR的胞內信號轉導區引入了CM，主要為CD28分子；第三代CAR引入了雙CM，主要為CD28分子加上CD134或CD137（圖1）。

圖1  第一代至第三代嵌合抗原受體（CAR）示意圖

CAR-T發展方向的研究將集中於設計更安全的第四代CAR、甄選具備最佳治療潛質的T細胞亞群。Kebriaei等於2012年闡述了如何從同種異體分離T細胞並轉染和篩選出CAR+ T細胞。2013年Singh等闡述了如何利用Sleeping Beauty system和人工抗原提呈細胞的方法製造出CAR表達率>95%轉染的T細胞，這種標準化的方法可為今後臨床注射應用提供穩定可靠的修飾T細胞。未來CAR-T治療將集中於優化臨床治療方案、完善臨床前試驗模型等方面。

二、CAR-T技術臨床應用

CAR-T在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、腦膠質瘤等惡性腫瘤治療中均顯示出良好的抗腫瘤效應，尤其是在白血病和淋巴瘤中。由於大多數B細胞惡性腫瘤表達CD19抗原，而多數B細胞惡性腫瘤應用現有方法難以治癒，CAR為解決這一問題提出了新思路。

1.  白血病

CAR-T療法對於復發性急性淋巴細胞白血病（ALL）是一種非常有前途的細胞免疫治療方式。通過對T細胞進行離體基因修飾和擴增，培養出足夠劑量的免疫細胞。儘管這些年在治療急性髓系白血病（AML）時化療和骨髓移植均取得進展，但還是有很多患者死於復發和病情惡化，研究發現AML患者對T細胞介導的異基因造血幹細胞移植敏感。隨著CAR-T療法的出現，用過轉染方式建立T細胞，表達CAR，可以針對已知的腫瘤相關抗原，對AML顯示出積極的療效。Ritchie等研究評價第二代CAR-T對AML的效果，通過對患者外周血和骨髓的PCR分析證實CAR-T持續存在10個月。4例患者均出現不同程度的療效，研究證實了T細胞治療高危AML的可行性和安全性，並證實了其持久性。

還有一項針對青少年ALL患者進行的Ⅰ期臨床試驗，研究20例復發性或難治性B前體細胞ALL（B-ALL）患者（年齡1～ 30歲），評估CAR-T療法的給藥、應答以及毒性。10例微小殘留病變（MRD）陰性患者接受了同種異體造血幹細胞移植（SCT），並在10個月中位隨訪期內保持緩解。6例患者發生3~ 4級細胞因子釋放症候群，給予抗白細胞介素-6治療。2011年Porter等使用慢病毒作為載體轉染T細胞，設計嵌合抗原受體T細胞，針對B細胞抗原CD19，其中CD137和CD3分子作為信號轉導域，治療慢性淋巴細胞白血病（CLL），注射後淋巴結消融，病情持續緩解10個月。2013年Kochenderfer等使用了來自於異體造血幹細胞捐獻者改造的anti-CD19 CAR-T，用於移植後B細胞惡性腫瘤的治療，結果表明供體改造的同種異體T細胞使B細胞惡性腫瘤緩解，其中1例CLL患者獲得持續完全緩解。

目前國內也已開展相關治療及臨床評價的研究，其中中國醫學科學院北京協和醫學院血液病醫院研發的CAR-T19和CAR-T33兩項技術成熟，分別在體內、外進行白血病細胞殺傷實驗，證明CAR-T19及CAR-T33細胞對表達CD19、CD33抗原的白血病細胞具有很強的殺傷效應，已申報相關專利。

2.  淋巴瘤

2010年首次報導anti-CD19 CAR-T治療應用於臨床，並取得良好效果，選取1例晚期淋巴瘤患者並經過治療達到緩解期，通過注射anti-CD19 CAR-T，使患者長期處於淋巴瘤緩解期，其中正常的CD19+ B細胞也長期被根除，表明anti-CD19 CAR-T發揮作用。Mihara等研究了anti-CD19 CAR-T和anti-CD38 CAR-T聯合利妥昔單抗對非霍奇金淋巴瘤的療效，發現經體外改造的T細胞對非霍奇金淋巴瘤有很強的細胞毒作用，並且可持續超過2個月。

3.  黑色素瘤

CAR-T療法在黑色素瘤中也顯示出巨大的應用價值，2006年就已經開始有黑色素瘤患者接受臨床試驗。此試驗包括17例轉移性黑色素瘤患者，其中2例患者病情完全控制，並在18個月內沒有復發。2011年Rosenberg等報導了CAR-T療法治療轉移黑色素瘤患者使其症狀得到改善，93例患者中有20例完全緩解，3年和5年的生存率分別為36%和29%，證明這種方法治療黑色素瘤有效。

三、CAR-T技術的發展及挑戰

CAR-T也存在局限性，這種技術風險高，是定製療法，臨床花費較大。CAR-T不僅會殺滅癌細胞，還會摧毀其他相關表達細胞，例如B細胞，患者可能一直需要持續注射丙種球蛋白。細胞因子風暴也是問題之一，2010年報導1例結腸癌合併肝和肺轉移患者在輸注後4 h血液就檢測出有高水平的幹擾素γ、腫瘤壞死因子α和IL-6等細胞因子，CAR-T注射後，識別並攻擊相關表達的正常肺細胞，釋放出大量細胞因子，患者經過5 d搶救後死亡。其次CAR-T技術在實體瘤治療方面不佳，但有報導通過改造和基因修飾PD1CD28信號通路可以增強CAR-T活性，通過多種機制有效對抗實體腫瘤，目前這種潛在的治療方法正在進行臨床研究。

在CAR-T治療領域，重點發展CAR-T專用的單鏈抗體製備技術、第四代CAR-T技術、慢病毒和非病毒表達技術、以中心記憶T細胞為主要表型CAR-T的高效/經濟製備技術。目前已製備好可應用於白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃癌、腸癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌等多種適應證的CAR-T技術體系。免疫治療是目前治療惡性腫瘤及其他疾病的重要輔助方法，目前CAR-T技術的臨床應用為腫瘤的免疫治療及其他疾病的治療提供了有力方法，特別是隨著更多腫瘤靶點的開發及技術改進，使CAR-T技術成為主流細胞治療手段。這一技術將會在一些疾病的發生、發展機制以及預防治療中發揮重要作用。

來源：白血病·淋巴瘤 2016,25(10):629-632

作者：師越 廖曉龍

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